МИНИСТЕРСТВО
УТВЕРЖДАЮ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
Заместитель руководителя
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ В.В. Селиверстов
07.10.99г. № 13-4-2-/1755
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по диагностике алиментарных
токсикозов у рыб
1. Общие положения
Алиментарные токсикозы рыб
вызываются веществами различной природы,
которые попадают в комбикорма с сырьем или образуются
в процессе
неправильного хранения корма. Токсический эффект проявляется
как в гибели
рыб, так и в различных патологических отклонениях
в их физиологическом
состоянии
Диагностика алиментарных токсикозов состоит из трех
этапов: 1 -
обследование рыбы (с целью выявления глубины токсикоза),
2 - исследование
корма и определение степени его токсичности, 3 - обнаружение
и количественное
определение токсического агента.
2. Обследование рыбы
Алиментарные токсикозы рыб проявляются, в зависимости
от дозы и
кратности поступления токсиканта, в острой и хронической
формах. Высокие
дозы токсиканта вызывают острые токсикозы, сопровождающиеся
массовой
гибелью рыб. При низких дозах интоксикация сопровождается
по истечении
определенного срока (около 30-40 дней) нарушением
обменных процессов,
замедлением роста, снижением резистентности и даже
гибелью наиболее
ослабленных экземпляров рыб.
2.1. Острые токсикозы вызываются дозами, значительно
превышающими
МДУ (максимально допустимые уровни), и приводят к
быстрой гибели рыб в
течение 1-3 суток. В зависимости от вида токсиканта
клинические признаки могут
быть самыми разными, но, как правило, поражаются нервная,
опорно-
двигательная или кроветворная системы.
2.2. Хронические токсикозы проявляются поэтапно. Их
проявление сходно с
симптомами, наблюдаемыми при неполноценном или несбалансированном
кормлении. Болезнь имеет несколько стадий развития.
1 стадия. Видимых клинических признаков заболевания
не обнаруживается
Отмечают отклонение показателей обмена веществ от
нормы, что проявляется в
снижении темпа роста, а иногда в форме катарального
воспаления
кишечника.
2 стадия. Длительное скармливание недоброкачественных
кормов приводит
к снижению естественной неспецифической резистентности
рыб, изменению
гематологических показателей, воспалению ануса, различных
отделов кишечника
и выделению слизистых тяжей вместе с экскрементами.
3 стадия. При длительном потреблении слаботоксичных
кормов болезнь
приобретает хроническую форму. При внешнем осмотре
рыб выявляют дряблость
мышц, симптом "острой спины", изменение окраски тела
и плавников, язвы и
кровоизлияния различной локализации, опухоли. При
патологоанатомическом
вскрытии отмечают ожирение печени, гидремию почек,
увеличение их объема,
наличие опухолей, асцит, энтерит. Хронические токсикозы
приводят к снижению
воспроизводительной функции, появлению физиологически
неполноценного
потомства, снижению резистентности. В отдельных случаях
рыбы могут
сохранять нормальные показатели темпа роста.
2.3. Для диагностики алиментарных токсикозов исследованию
подвергают
по 10 рыб из каждой группы. Рыбы исследуемой группы
считаются больными,
если выявлено не менее 20 % рыб с нарушением обмена
веществ. Диагноз
устанавливают по среднегрупповым значениям показателей
в выборке, а по
индивидуальным - с учетом симптоматики заболевших
рыб.
2.4. Для диагностики стадии течения токсикозов используют
различные
физиолого-биохимические методы. Для выявления нарушений
используют не
менее 5-10 физиолого-биохимических показателей (белок,
остаточный азот, азот
аминокислот, мочевина, липиды, холестерин, глюкоза,
мочевая кислота,
аспартатаминотрансфераза, холинэстераза сыворотки
крови и др.). На этой стадии
заболевание диагностируют гематологическими методами,
подробно
изложенными в "Методических указаниях по проведению
гематологического
обследования рыб", утвержденных Департаментом ветеринарии
Минсельхозпрода
России 02.02.99 г., № 13-4-2/1487. Степень патологических
отклонений
определяется гистологическими методами.
2.5. Любой токсический агент, содержащийся в комбикормах,
может
вызывать неспецифическую реакцию организма рыб: повышение
содержания
глюкозы в крови, снижение содержания белка и гидремию,
увеличение
содержания гликогена в печени. Картина крови характеризуется
микроцитарной
базофильной или полихроматофильной анемией.
2.6. Одновременно с неспецифической реакцией каждый
из алиментарных
факторов вызывает заболевание рыб, отражающееся в
специфическом изменении
обменных процессов. Характер изменений физиолого-биохимических
показателей обмена веществ и клинические признаки
у рыб при токсикозах,
вызванных некоторыми распространенными алиментарными
факторами,
приведены в приложении 1.
3. Исследование корма
Качество кормов оценивают на общую токсичность по
выживаемости тест-
объектов. При выявлении их токсичности специальными
методами определяют
наличие в них окисленных жиров, микотоксинов, тяжелых
металлов, пестицидов
и других загрязнителей (Санитария кормов: справочник,1991).
3.1. Максимально допустимые уровни (МДУ) содержания
патогенных
факторов в комбикормах
3.1.1. Для карпа (от сеголетков до товарной рыбы)
МДУ на продукты окисленных жиров разработаны для хозяйств
с низкой
естественной кормовой базой. Для всех возрастов карпа
недопустимо
превышение:
- кислотного числа: 50 мг КОН в 1 г жира;
- перекисного числа: 1,0 % йода;
- альдегидного числа: 1,0 Е г/100 мл/см (в единицах
оптической плотности).
МДУ микотоксинов:
- Т-2 -токсин: 0,05 мг/кг корма,
- ДОН-токсин: 3,33 мг/кг корма.
Суммарное содержание продуктов микробиосинтеза: паприна
(БВК, дрожжи
на нефтепарафинах), гаприна (БВК, дрожжи на природном
газе), гиприна
(гидролизные, кормовые дрожжи) - 5 % массы корма,
Для лососевых рыб
- перекисное число - 0,2% йода для стартовых кормов
и 0,3% - для
продукционных;
МДУ на афлатоксины не разработаны
- радужная форель наиболее чувствительна к афлатоксинам;
- афлатоксин b| (0,03 - 0,06 мг/кг корма) вызывает
массовую гибель мальков:
- концентрации 0,5-1,0 мг/кг корма вызывают образование
опухоли печени;
-афлатоксины В2, g1 и С2 встречаются в кормах реже
и в меньших
концентрациях, чем афлатоксин b1, они также уступают
ему в токсичности и
канцерогенности;
МДУ на госсипол для рыб не разработаны
- доза 0,1 г/кг - вызывает изменения гематологических
показателей и
нарушает процесс синтеза белка;
- доза 0,3 г госсипола на 1 кг корма подавляет рост
рыб.
3.2. Определение токсичности фуражного зерна, продуктов
его переработки
и комбикормов с использованием рыб-гуппи
При санитарной оценке концентрированных кормов их
необходимо
исследовать на токсичность, которая может быть обусловлена
за счет наличия в
кормах химических соединений и микотоксинов. Для этой
цели в соответствии с
ГОСТ отбирают средние пробы кормов и отправляют в
лабораторию на
исследование, при котором определяют общую токсичность
и присутствие
микотоксинов.
3.2.1. Определение общей токсичности.
Исследования проводят по Методике, утвержденной ГУВ
МСХ СССР
04.06.1980г. Принцип методики основан на извлечении
из фуражного зерна,
продуктов его переработки, комбикормов ацетоном жиро-
и водорастворимых
фракций токсических веществ и последующем воздействии
этих (фракций на
аквариумных рыб-гуппи.
Методика позволяет определить токсичность концентрированных
кормов в
течение суток без учета времени подготовки образцов
для тестирования.
Пробу фуражного зерна (ячмень, овес, пшеница, горох,
кукуруза, просо) 50 г
тщательно измельчают на лабораторной мельнице (отруби
и комбикорма
экстрагируют без измельчения), помещают в плоскодонную
колбу с притертой
пробкой, заливают 150 мл ацетона и экстрагируют при
встряхивании на шуттель-
аппарате в течение двух часов.
Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в фарфоровую
чашу и
выпаривают под тягой на водяной бане (Т 55-60°) досуха.
Сухой остаток
растворяют в 5 мл ацетона и переносят его в химический
стакан (емкостью 700-
800 мл, диаметром 11-15 см) с 500 мл воды из аквариума
комнатной температуры
(17-20°). Экстракты из комбикормов, кукурузы, гороха
и проса после растворения
в воде помещают в бытовой холодильник на 40-45 мин.
при Т 6-7°С, по истечении
срока экстракты фильтруют через небольшой слой ваты,
подогревают до
исходной температуры (17-20'). В воду с экстрактом
помещают 5 рыб-гуппи
независимо от пола, возраста, за которыми ведут наблюдение,
отмечая их гибель
через 24 часа (гуппи, вышедшие из опыта, выбраковываются),
Примечание. Если фуражное зерно, продукты его переработки
и комбикорм
окажутся токсичными, такие партии кормов немедленно
исключаются из рациона
и проводят дополнительные дифференциальные исследования
на хлор- и
фосфорорганические соединения, препараты ртути, алкалоиды
(по ранее
разработанным методикам) и микотоксины.
3.2.2. Определение микотоксинов.
Методика основана на извлечении микотоксинов из фуражного
зерна,
продуктов его переработки, комбикормов, частичной
очистки экстракта гексаном
от липидов и некоторых неполярных хлор- и фосфорорганических
соединений с
последующей переэкстракцией микотоксинов хлороформом
и исследованием на
рыбах-гуппи. Методика позволяет определить токсичность
в течение 24-30 часов.
Пробу фуражного зерна 50 г тщательно измельчают на
лабораторной
мельнице (отруби и комбикорма экстрагируют без измельчения),
помещают в
плоскодонную колбу с притертой пробкой, заливают 150
мл ацетона и
экстрагируют при встряхивании на шуттель-аппарате
в течение двух часов или в
статическом состоянии - 20 часов. Экстракт фильтруют
через бумажный
обеззоленный фильтр в фарфоровую чашку и упаривают
под тягой на водяной
бане (55-60°) до объема 45-50 мл. Остаток переносят
в делительную воронку, в
которую добавляют 10 мл воды. Содержимое чашки смывают
5 мл ацетона,
сливают в делительную воронку и встряхивают одну минуту.
Затем в воронку
вносят 50 мл гексана и встряхивают 1 -2 минуты. После
разделения слоев -
нижний сливают в другую делительную воронку и дважды
экстрагируют 40 мл
хлороформа (в каждом случае встряхивают две минуты).
Гексановую фракцию,
при необходимости, исследуют на хлор и фосфорорганическое
соединения. После
разделения слоев хлороформные фракции (нижний слой)
сливают в фарфоровую
чашку и упаривают под тягой на водяной бане (55-60°)
до исчезновения
хлороформа (досуха). Сухой остаток растворяется 5
мл ацетона и переносят его в
химический стакан с 500 мл воды (17-20°), взятой из
аквариума. В раствор
экстракта помещают пять гуппи независимо от пола и
возраста, за которыми
ведут наблюдение, отмечая их гибель через 24 часа.
Для повышения
биологической достоверности результатов численность
тест-организмов
необходимо увеличить до К) штук, то есть проводить
биоанализ в двух
повторностях.
3.2.3. Результаты определения.
В зависимости от степени токсичности исследуемого
корма гуппи погибают
в сроки, указанные в таблице 1.
Таблица 1 Оценка степени токсичности исследуемого корма
| Степень токсичности кормов | Количество погибших гуппи,экз. | Время гибели, (в часах) |
| Нетоксичный | Не более 1 | В течение 24 час. |
| Слаботоксичный | 2-4 | - " - |
| Токсичный | 5 |
3.3. Определение токсичности кормов с использованием
инфузории
Тетрахимена пириформис
Исследования проводят в соответствии с «Методическими
рекомендациями
по биологической оценке продуктов животноводства и
кормов с использованием
тест-объектов тетрахимена пириформис», М., ВАСХНИЛ,
1977 г. (М., Колос,
1978 г.). Работу проводят следующим образом. Взятые
на анализ пробы кормов
тщательно перемешивают и растирают в ступке. Берут
ряд навесок (не меньше 3 -
5) в количествах, обратно пропорциональных предполагаемой
токсичности, но не
более 300 мг в наибольшей по массе навеске. Их вносят
в пробирки или флаконы
и заливают по 2 мл чистой кипяченой воды, закрывают
резиновыми пробками с
вырезкой для доступа воздуха, что предотвращает выбрасывание
пробок при
нагревании флаконов. Прогревают в водяной бане (или
стерилизаторе) 15 - 20
мин. при температуре 80-90°С. После охлаждения до
комнатной температуры во
флаконы вносят по 0,05 мл культуры Тетрахимены пириформис,
разведенной
перед этим водой в К) раз, и ставят в термостат при
+25°С или в обычный шкаф в
затемненное место при комнатной температуре на 1-4
суток.
Наличие роста, его степень контролируют каждые сутки
под микроскопом
(МБС - микробиологический стереоскопический) при увеличении
2х8. Это
позволяет просматривать пробы прямо в пробирке или
флакончике, не беря их
пипеткой, что является предварительным контролем,
за которым следует
просмотр в капле под МБИ (увеличение 7х90). Каплю
помещают на предметное
стекло пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой,
просматривают весь
объем, вес слои. Контролем является водопроводная,
дехлорированная путем
кипячения вода, в которую одновременно с опытом также
засевают культуру
инфузорий.
Угнетение подвижности, наличие гибели, даже единичных
особей или их
деформации свидетельствуют о токсичности или другой
вредности исследуемого
материала. Определенную вредность продукта характеризует
замедление роста и
размножения инфузорий. Для этого на 4-е сутки производят
количественный учет
выросших особей в счетной камере Фукс-Розенталя или
Горяева, но чаще всего
ограничиваются примерным учетом погибших особей путем
просмотра капли
среды в трехкратной повторности, наличием каких-либо
отклонений в
подвижности и внешнем виде инфузорий. В совокупности
эти наблюдения
позволяют сделать вывод о степени токсичности исследуемого
корма (продукта) и
охарактеризовать ее в баллах:
Таблица 2
| Оценка токсичности | Результаты наблюдений | |||
| алл | корма, продукта | рост | гибель клеток | Другие изменения |
| Нетоксичный | Густой | Нет | Нет | |
| Слаботоксичный | Несколько угнетен | Нет | Возможны | |
| Умеренно токсичный | Сильно угнетен | Нет | Возможны | |
| Токсичный | Очень сильно угнетен | Часть погибла | Возможны | |
| Сильно токсичный | - | Полная гибель клеток | - | |
Целесообразно делать и подсчет выросших особей. Для
этого во все
(флаконы вносят по 3 мл фиксирующего раствора, например,
формалина,
приготовленного по следующей прописи: 20 мл 33% формалина,
175 мг kh2po4,
170 мг К2НР04 и 440 мл дистиллированной воды.
Количество инфузорий в каждом флаконе, соответствующем
разведению
(титру) корма, выражают в процентном отношении к контролю
(засеянному на
стандартную среду, разведенную водой в 10 раз) и выдержанному
в то же самое
время, что и опыт. На основании полученных цифр проводят
соответствующие
расчеты угнетения роста и гибели по правилам общей
токсикологии. При
необходимости используют и полулогарифмическую сетку
пробит-анализа.
Кроме того, пробы, непоказавшие гибели или других
патологических
изменений тетрахимены в течение 1-4 суток, оставляют
на дальнейшую
инкубацию до 7 суток для выявления возможной кумуляции,
т.е. накопления
токсического эффекта, характеризующегося замедлением
развития, частичной
гибелью и другими изменениями жизнедеятельности данного
тест-объекта. Их
наличие также выражают в баллах или в процентах от
количества особей в опыте
и по отношению к контролю.
Культурная стандартная среда для тетрахимены пириформис:
2 г пептона
бактериологического; 0,5 г глюкозы; 0,1 г дрожжевого
экстракта;
0.1 г морской соли аптечной (или 0,1 r naci) на 100
мл дистиллированной воды.
Среду подвергают автоклавированию при 0,5 атм. 30
мин или в кипящей водяной
бане 1 час. Хранят в темном месте, т.к. на свету питательные
компоненты
разлагаются. Слой среды не должен превышать 1,5 -2
см. Культуру поддерживают
путем пересева каждые 7-10 суток на новую среду.
3.4. Экспресс-метод определения общей токсичности фуражного
зерна,
продуктов его переработки и комбикормов с использованием
инфузорий
стилонихий.
Биологический экспресс-метод определения токсичности
введен с 1 января
1993 г. в ГОСТ 13496.7-92 "Зерно фуражное, продукты
его переработки,
комбикорма. Методы определения токсичности" и ГОСТ
29136-91 "Мука
кормовая из рыбы, морских млекопитающих, ракообразных
и беспозвоночных.
Методы определения токсичности".
Экспресс-метод основан на качественном и количественном
определении
реакции инфузорий стилонихий на действие различных
фракций токсических
веществ (бактериальной, грибковой и химической природы),
извлекаемых
ацетоном из исследуемого продукта, совместно с действием
мелкодисперсной
взвеси продукта, находящейся в его водно-ацетоновом
растворе. Токсический
эффект оценивается через 1 час, при этом одновременно
проводятся
качественный и количественный анализ В первую очередь
осуществляется
качественный анализ. Визуально, с помощью микроскопа
МБС-10 (увеличение
2х8), оценивается подвижность инфузорий во всех тестируемых
пробах
(комбикорма или их компоненты). При отсутствии токсичности
инфузории
подвижны. В токсичных пробах инфузории неподвижны.
Далее проводят
количественный анализ в пробах с неподвижными инфузориями.
В этом случае
токсический эффект оценивается по проценту гибели
инфузорий, который про-
порционален степени токсичности продукта. Погибшие
организмы полностью
распадаются (лизируются), что облегчает количественный
подсчет выживших
организмов.
3.4.1. Определение общей токсичности на инфузориях
стилонихиях
визуальным методом.
3.4.1.1. Необходимое оборудование и материал Для осуществления
метода
экспрессного биотестирования требуется следующее оборудование:
1.Микроскоп бинокулярный стереоскопический.
2. Весы лабораторные 4 класса.
3. Мельница электрическая лабораторная.
4.Шкаф сушильный.
5. Планшетка с 50 лунками 1шт.
6.Колбы конические для экстракции емкостью 100мл -
15шт,
7.Химические стаканы емкостью 100мл- 15шт.
8.Шприц многоразовый с дел. на 0.5мл-1шт.
9.Пипетки мерные Мора на 25мл, 20мл и 15мл - по 1шт.
10.Цилиндр мерный на 100 мл - 1 шт. 11.Часы песочные
на 2 мин,- 1шт.
12.Пипетки для пересадки инфузорий - 50шт.
13. Чашки Петри - 30шт.
14.Дрожжи пекарские прессованные (ГОСТ 171-81) - 50г.
15.Бумага фильтровальная.
16. Карандаш по стеклу.
17. Ацетон марки Ч ДА, ОСЧ - 1,5л на 100 анализов
18. Спирт этиловый 1,75л на 100 анализов + 100мл на
каждые 100
пересевов культуры.
19. Сито с ячеёй 0,5мм.
3.4.1.2. Подготовка пробы к биотестированию Пробу кормовой
муки, сырья
и комбикормов в количестве немногим более 10 г (1
столовая ложка) измельчают
на лабораторной электрической мельнице в течение 1-2х
минут и просеивают
через сито с ячеёй 0,5 мм. Навеску пробы (10 г) помещают
в стеклянную посуду
для экстракции емкостью 100 мл с притертой пробкой
(можно использовать
баночки из-под детского питания на 100 г с крышкой),
заливают 15мл ацетона и
экстрагируют при энергичном встряхивании в течении
2-х минут. Экстракту дают
отстояться в течение 10 минут, после чего прозрачный
надосадочный экстракт в
количестве 0,5мл осторожно отбирают шприцем и переносят
в химический стакан
со средой для культивирования инфузорий, объем которой
указан в таблице 3.
Приготовленные водные растворы ацетоновых экстрактов
мясо костной и
рыбной муки, дрожжей гидролизных, БВК, и жиросодержащих
продуктов
(кукуруза, шроты) перед проведением биотестирования
необходимо
профильтровать через слой фильтровальной бумаги.
Таблица 3
Приготовление водного раствора ацетонового экстракта
кормовой муки, сырья и комбикормов
| №
п.п. |
Вид продукта | Навеска пробы, г | Кол-во ацетона, МЛ | Кол-во ацетона экстра-та, мл | Кол-во воды, мл |
| 1. | Комбикорма для садкового рыбоводства, карповые | 10 | 15 | 0,5 | 50 |
| 2. | Комбикорма для свиноводства и птицеводства | 15 | 40 | ||
| 3. | Зернофураж и продукты его переработки | 15 | 40 | ||
| 4. | Шроты | 15 | 40 | ||
| 5. | Мука травяная | 20 | 40 | ||
| 6. | Мука рыбная, крилевая, мясокостная | 15 | 80 | ||
| -7 | Мука кровяная (альбумин) | 15 | 50 | ||
| 8. | Молоко сухое | 15 | 80 | ||
| 9. | Дрожжи гидролизные | 15 | 45 | ||
| 10. | Белотин | 20 | 50 | ||
| 11. | Контроль | 0,5 | 50 |
3.4.1.3. Подготовка тест-организмов для биотестирования.
В качестве тест-
объекта используется инфузория стилонихия stilonichia
mytilus (ehrenberg).
относящаяся по систематике Догеля к классу infusoria,
подклассу ciliata, отряду
spirotriha, подотряду hipotricha.
Для биотестирования используется клонально-смешанная
культура,
которая постоянно поддерживается в отделе МКЦП “Марикультура”
Всероссийского научно-исследовательского института
рыбного хозяйства и
океанографии (ВНИРО).
Для биотестирования используют суточную культуру инфузорий.
Для этого
инфузорий за сутки до постановки опыта из нескольких
резервных чашек Петри
пересаживают в большом количестве (200-500 экз.) в
чашку Петри с новой средой
и культивируют при температуре 24-2С) °С с добавлением
корма (на 25 мл среды
1 кусочек сухих пекарских дрожжей размером с маковое
зернышко, т.е. весом
около 0,003 г), при этом инфузории концентрируются
вокруг корма.
.gif){kind=small}
.gif){kind=small}