3.4.1.4. Проведение биотестирования
Испытания начинают с отбора пипеткой тест-организмов, сконцен-
трированных вокруг корма в чашке Петри, и внесения их в каждую лунку
планшетки по одной капле, при этом в лунку попадает около 20 шт. инфузорий.
Биотестирование проводят в лунках с рабочим объемом 0,4 мл, высверленных и
отполированных в пластине из оргстекла (10 рядов по 5 шт. в каждом). Для
тестирования одной пробы используют 5 повторностей (5 лунок). При пересадке
инфузорий пользуются одной пипеткой (культуральной), а при внесении в лунки
подготовленной для тестирования пробы пользуются другой пипеткой (для
опыта). Регистрация тест-организмов осуществляется визуально с помощью
микроскопа бинокулярного в лунках, которые полностью попадают в поле зрения
микроскопа при увеличении 2х8.
Через один час после внесения пробы в случае токсичности комбикорма
(сырья), происходит гибель инфузорий, величина которой зависит от степени
токсичности комбикорма. Погибшие организмы полностью лизируются, в
результате чего облегчается проведение количественного подсчета выживших
инфузорий.

Порядок проведения испытания следующий:
- инфузорий под бинокуляром в массе отбирают культуральной пипеткой из
чашки Петри, где они сконцентрированы вокруг корма, и по одной капле
помещают в каждую из пяти лунок планшетки, при этом в каждую каплю
попадает примерно от 10 до 20 шт. инфузорий (это количество используют в
опыте);
- просматривают под бинокуляром количество инфузорий в каждой лунке
планшетки и, если их слишком много в одной и недостает в других, то инфузорий
более-менее равномерно распределяет в лунки планшеток той же пипеткой;
-после распределения инфузорий для их обездвиживания в каждую лунку
планшетки вносят другой пипеткой по 2 капли приготовленной для
биотестирования пробы, удаляя жир с пипетки сухой ватой;
- через 5 минут подсчитывают инфузорий в каждой лунке планшетки и
заносят их количество в журнал;
- после подсчета инфузорий в лунки планшетки (до 1/2 их объема) вносят
этой же пипеткой приготовленную для биотестирования пробу, также вытирая
пипетку от жира ватой, и регистрируют время в журнале;
- через один час экспозиции вторично подсчитывают количество инфузорий;
  - рассчитывают численность инфузорий через 1час экспозиции в % от числа
посаженных по формуле:

               n2 x 100%
n=  --------------------------------------,
                  n1
ГДЕ:
n1 - общая численность посадки инфузорий
n2 - общая численность инфузорий через 1 час экспозиции.

3.4.1.5. Анализ результатов
Степень токсичности исследуемого корма оценивается через 1 час по
количеству выживших инфузорий в % от численности их посадки в соответствии
со шкалой, указанной в таблице 4. В качестве контроля используют
однопроцентный водный раствор ацетона, в котором инфузории в течение 1 часа
должны остаться живыми. Контроль ставится с целью определения качества
ацетона и среды.

Таблица 4 Оценка степени токсичности исследуемого корма
 

Степень токсичности	Выживаемость инфузорий в % от посадки через 1 час опыта (n)
Нетоксичный	100-81
Слаботоксичный	80-50
Токсичный	49-0

3.4.1.6. Культивирование инфузорий стилонихий
Культивируют стилонихий в закрытых чашках Петри на среде Лозина-
Лозинского (см. ниже); в качестве корма используют сухие пекарские дрожжи,
которые добавляют в среду во время пересева культуры. При проведении
большого числа анализов (более 10 ежедневно), а также в зимний период
(особенно в феврале - марте) необходимо одновременно культивировать не менее
8 чашек с инфузориями, поддерживая оптимальную температуру 24-26° С.
Помещение для работы с инфузориями должно быть изолировано от химической
лаборатории, воздух не должен содержать никаких вредных паров и химических
примесей.
Недопустимо попадание прямых солнечных лучей на чашки Петри с
культурой инфузорий.

Подготовка корма. Корм для инфузорий - сухие пекарские дрожжи,
которые готовят, следующим образом. Свежие прессованные дрожжи (брикет 100
г) измельчают и высушивают в течение 1 недели, закрывая от пыли бумагой, при
комнатной температуре, после чего хранят в баночке с притертой крышкой. Срок
хранения сухих дрожжей -12 месяцев.

Среда культивирования. Для культивирования инфузорий используют
среду Лозина-Лозинского, которую готовят на дистиллированной воде с
добавлением следующих солей (г/л): nacl -0,1; kcl - 0,01; nahco3-0,02;
mgso4-0,0 l; cacl2-0,01.

Пересев культуры. Пересев культуры производят каждый раз за сутки до
постановки опыта. Если экспериментальная работа не проводится, то культуру
инфузорий пересаживают не менее 2-х раз в неделю в зависимости от
температуры.
Перед добавлением корма пальцы рук и пинцет необходимо протереть
спиртом.
Пересев культуры инфузорий из нескольких резервных чашек (обычно 4) в
новую чашку Петри осуществляют пипеткой, при этом кончик пипетки должен
быть полностью погружен в среду. После пересева чашку Петри ставят на место,
где проводят культивирование и только после этого добавляют корм (на 25мл
среды - 1 кусочек сухих пекарских дрожжей размером с маковое зернышко).
Передозировка корма недопустима, поскольку она может привести к угнетению
инфузорий или их полному исчезновению. При передозировке вокруг корма через
сутки образуется облачко молочного цвета, которое необходимо убрать пипеткой,
что несколько улучшит состояние культуры инфузорий.
После добавления корма чашку Петри с культурой не трогают в течение 4-х
часов для получения концентрированной культуры инфузорий.
После пересадки культуры на крышке чашки Петри карандашом по стеклу
ставят дату пересева., При отборе инфузорий из резервных чашек (во время
пересева) сливают большую часть старой среды, доливают свежей среды до
половины объема чашки и добавляют корм. Таким образом, эти чашки можно
использовать несколько раз для дальнейшего пересева инфузорий.

Требования к посуде. Лабораторная посуда должна использоваться только
для работы с инфузориями. Подготавливают ее следующим образом: Чашки
Петри, химические стаканы, шприц, посуду для экстракции комбикормов или
сырья моют раствором стирального! порошка или мыльным раствором и
ополаскивают проточной водой (после стирального порошка не менее б раз).
Планшетки моют только мыльной пеной, используя боковую поверхность
пробирочного ерша, ополаскивают водой, а затем чистоту лунок проверяют под
микроскопом МБС-10 (увеличение 2х8). После биотестирования
жиросодержащих продуктов (мука рыбная или мясокостная, шроты, жмыхи,
кукуруза и проч.) дно лунок может быть покрыто белым налетом, который
удаляют обильно намыленной ватой.

Планшетки после мытья сушат только на воздухе. Чашки Петри и
пинетки прокаливают в -сушильном шкафу в течение 1часа при температуре не
менее 110° С. Хранят посуду в защищенном от пыли месте.

Транспортировка культур. Транспортируют культуру инфузорий в
герметично закрытых банках емкостью 100мл. Баночку наполовину заливают
средой, пересаживают культуру инфузорий, добавляют корм и закрывают,
проверив на герметичность. Чтобы не допустить перегрева или охлаждения ее
помещают в банку большего объема, обкладывают со всех сторон бумагой и
закрывают крышкой. Зимой банку снаружи обертывают газетой в три слоя и
помещают в полиэтиленовый пакет. В такой упаковке культура инфузорий в
закрытом виде может храниться одну неделю.
Начиная работу на новом месте, необходимо прежде всего нарастить
достаточную биомассу инфузорий не менее, чем в 4-х чашках Петри.

3.4.2. Определение общей токсичности на инфузориях с помощью
автобиоанализатора.
Автобиоанализатор - комплексное устройство, сочетающее биологический
экспрессный метод и компьютерный анализ. Автобиоанализатор осуществляет
подсчет живых инфузорий и оценку степени токсичности в автоматическом
режиме, при этом, в отличие от визуального метода, в качестве показателя
токсичности используется более чувствительная, чем выживаемость, тест-
функция - снижение двигательной активности инфузорий стилонихий.
Использование прибора позволяет автоматизировать самую трудоемкую часть
работы при биотестировании экспресс-методом, исключить фактор
субъективности при подсчете количества инфузорий. Рекомендуется использовать
на предприятиях, где количество проб в день составляет больше пяти.

3.4.2.1. Необходимое оборудование и материалы
Для осуществления автоматизированного метода экспрессного био-
тестирования требуется следующее оборудование:
1. Автобиоанализатор
2.Микроскоп бинокулярный стереоскопический.
3. Весы лабораторные 4 класса.
4.Мельница электрическая лабораторная.
5.Шкаф сушильный.
6. Круглая планшетка с 16 лунками 1шт.
7. Колбы конические для экстракции емкостью 100мл - 15ют.
8.Химические стаканы емкостью 100 мл – 15шт.
9.Шприц многоразовый с дел. на 0.5 мл-1шт.
10.Пипетки мерные Мора на 25мл, 20 мл и 15мл - по 1шт.
11 .Цилиндр мерный на 100 мл -1 шт.
12.Часы песочные на 2 мин.- 1шт.
13.Пипетки для пересадки инфузорий - 50шт.
14.Чашки Петри - 30шт.
15.Дрожжи пекарские прессованные (ГОСТ 171-81) - 50г.
16. Бумага фильтровальная.
17. Карандаш по стеклу.
18.Ацетон (марки ЧДА,ХЧ,ОСЧ) - 1,5л на 100 анализов.
19.Спирт этиловый 1,75л на 100 анализов + 100мл на каждые 100
           пересевов культуры.
20.Сито с ячеёй 0,5мм.

3.4.2.2 .Характеристика автобиоанализатора
В состав автобиоанализатора входят: компьютер ibm/pc-486, биодетектор,
подсистема позиционирования, программный комплекс анализа токсичности.
Биодетектор - устройство преобразования оптического изображения лунки с
инфузориями в аналоговой телевизионный сигнал, состоит из оптической и
электронной подсистемы.
Оптическая подсистема обеспечивает надежную видимость объекта
размером 200 - 250 мкм (инфузория стилонихия) и захват в поле зрения
телекамеры всей лунки микроаквариума диаметром 14 мм и глубиной 6 мм.
Электронная часть представлена видеокамерой и интерфейсной платой
ввода и оцифровки изображения в компьютер и управления шаговым двигателем -
подсистема позиционирования.
Подсистема позиционирования планшетки с микроаквариумами состоит из
контроллера перемещения, механического устройства и программного драйвера.
Драйвер осуществляет управление контроллером перемещения и обеспечивает
связь между программой ввода и обработки изображения и контроллером. При
включении программы подсистема позиционирования устанавливает планшетку в
начальное положение, и лунка n 1 круглой планшетки попадает в поле зрения
объектива телекамеры. Положение первой лунки определяет герконовый контакт,
который срабатывает, когда платформа с планшеткой переместится до начального
положения (на платформе в этом месте закреплен магнит). В дальнейшем, при
включении команды "Шаг" (с помощью клавиатуры, или мыши) или в режиме
полного автоматического определения токсичности, система позиционирования
передвигает планшетку на каждую следующую позицию. Механическая часть
системы позиционирования, состоящая из шагового двигателя, редуктора и
платформы, обеспечивает позиционирование планшетки с точностью 3%.
Программа обеспечивает: удобную настройку системы; определение
степени токсичности одного или нескольких образцов в заданном числе лунок;
ввод и редактирование необходимой дополнительной информации; запись
полученных результатов на диск и чтение их с диска; распечатку полученных
результатов на принтере.

3.4.2.3. Требования к условиям анализа и параметрам программы
- температура в лунке в момент измерения должна поддерживаться на
уровне 24- 26° С.
- время экспозиции инфузорий в лунке после их пересадки из чашки Петри
перед первым подсчетом составляет не менее 15 мин. и зависит от установления
оптимальной температуры и чистоты лунки.
- для работы используется только суточная культура инфузорий. Культура
более старшего возраста (2-3 суточная) характеризуется нестабильной реакцией
на токсические вещества и более высокой устойчивостью к ним;
- для создания оптимальных оптических условий следует обеспечить
тщательную полировку лунки и выбор такого объема в раствора, чтобы его
уровень в лунке не превышал 4 мм, что достигается при внесении в лунку 6-7
капель раствора;
- освещение лунки обеспечивается люминесцентной лампой. Основной
критерий правильности выбора освещенности - исключение зон засветки и
затемнения в изображенной на мониторе картинке лунки со средой;
- оптимальная плотность инфузорий - в пределах 50-70 клеток в лунке;
- особенно строгое требование предъявляется к чистоте лунки, критерием
которой служит отсутствие в контроле подавления активности инфузорий через 1
час после первого подсчета (первый подсчет производится через 20-30 мин. после
посадки инфузорий в лунку)
3.4.2.4. Подготовка пробы к биотестированию см. п. 3.4.1.2.

3.4.2.5. Подготовка тест-организмов для биотестирования см. п. 3.4.1.3.

3.4.2.6. Внесение тест-организмов.
Испытания начинают с отбора пипеткой тест-организмов, сконцен-
трированных вокруг корма в чашке Петри, и внесения их в каждую лунку
планшетки по три капли; при этом в лунку попадает около 50 шт. инфузорий. Для
тестирования одной пробы используют две повторное™ (2 лунки заполняют
экстрактом одного продукта). Всего в планшетке - 16 лунок, таким образом,
одновременно может быть протестировано 7 проб исследуемых продуктов, а 2
лунки используются для контроля.
При пересадке инфузорий пользуются одной пипеткой (культуралъной), а
при внесении в лунки подготовленной пробы пользуются другой пипеткой
(опытной). Диаметр капиллярного отверстия пипетки должен быть калиброван и
составлять 250 ± 1 мкм.
В качестве контроля используют 1% раствор ацетона, в котором инфузории
в течение 1 часа должны оставаться живыми. Контроль ставится с целью
определения качества ацетона и Среды для культивирования инфузорий.

3.4.2.7. Подсчет количества тест-организмов с помощью
автобиоанализатора,
За 10 - 15 мин. до установки на платформу планшетки с внесенными в лунки
инфузориями необходимо включить лампу подсветки для подогрева платформы
до 24-26°С, т.е. температуры культивирования. В противном случае активность
инфузорий и, соответственно, результаты подсчета будут изменяться в
зависимости от колебания температуры.
Первоначальный подсчет ("первое измерение") инфузорий начинают через
30 мин. после установки планшетки на платформу с целью выравнивания их
температур. На штативе вблизи платформы устанавливают термометр для
контроля температуры и исключения ее колебания в зоне проведения измерений.

Подсчет осуществляется в соответствии с алгоритмом:
1. Включить компьютер.
2. Включить переключатель авторегистратора.
3. Поместить планшетку на платформу авторегистратора.
4. В режиме "Настройка/ живое видео" проверить качество изображения;
подстройка резкости изображения производится поворотом объектива.
5. В автоматическом режиме запустить программный модуль подсчета тест-
организмов.
6. По окончании подсчета включить переключатель авторсгистратора.

3.4.2.8. Внесение пробы
Пипеткой, используемой в опыте, водный раствор тестируемого продукта
вносят в лунки планшетки (экстракт одного продукта - в 2 лунки) в количестве 4
капель, не касаясь кончиком пипетки поверхности среды с внесенными ранее
инфузориями.

3.4.2.9. Повторный подсчет
Через один час после внесения пробы осуществляется подсчет численности
подвижных инфузорий.
Повторный подсчет ("второе измерение") количества подвижных тест-
организмов осуществляется по алгоритму, указанному в п. 3.3.2.7.
Результат токсикологического анализа выдается на экран монитора, принтер
и/или файл.

3.3.2.10. Способ культивирования   инфузорий стилонихий см. п. 3.3.

Приложение 1
К методическим указаниям по диагностике алиментарных
токсикозов у рыб, утв. 7 октяборя 1999 г.
 
 

Токсическое вещество	Признаки
Т-2 токсикоз	Снижение содержания белка, липидов и холестерина, повышение азота аминокислот и мочевины в сыворотке крови; при остром токсикозе изменение гематологических показателей не наблюдается, при длительном воздействии малых доз токсина обнаруживается снижение концентрации гемоглобина и гематокритной величины.
Дезоксинива-ленол (ДОН)	Содержание белка в сыворотке не меняется, содержание холестерина имеет тенденцию к повышению.
Афлатоксикоз	Рыба становится вялой, не реагирует на внешние раздражители. Наблюдают потемнение покровов тела, ерошение чешуи, вздутие брюшка. При вскрытии полости тела обнаруживают внутриполостную жидкость. Печень с желтовато - белыми узелками или серовато-беловатыми опухолями, сильно увеличена. Опухоли дают метастазы по всей печени и во внутренние органы. Множественные опухоли белого цвета и плотной консистенции чаще встречают в пилорическом отделе желудка, реже - в среднем и заднем отделах кишечника. В паренхиме печени отмечают гиперемию. Наблюдают выпячивание слизистой оболочки ануса, кровенаполнение селезенки, отечность, дряблость и серую окраску почек.
Госсипол	В начальной стадии подавляется роет и изменяются гематологические показатели. При сильных токсикозах отмечают отклонения в печени и почках: гломерулонефрит, некроз печени, селезенки и почек. У белого амура в полости тела обнаруживают либо толстый розовый слой стеариноподобного жира, который окружает внутренние органы, либо бледно- желтый экссудат, при накоплении которого у отдельных рыб появляется пучеглазие.
Продукты окисления жиров	В начальной стадии отмечают повышение содержания малонового диальдегида в мышцах рыб, а также повышение скорости его образования, торможение роста. Повышение гемодиза эритроцитов и активности кислой ДНК-азы в мышцах. При длительном скармливания комбикормов с сильно окисленными жирами наблюдается повышение содержания остаточного азота аминокислот сыворотки, снижение гемоглобина, гематокритного числа и СОЭ, торможение роста рыб.
Высокие дозы паприна, ги-прина и др. продуктов микробиосинтеза	Длительное кормление вызывает снижение общей рези-стентности содержания белка, азота, аминокислот и ли-пидов в сыворотке.