МИНИСТЕРСТВО
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА                                Утверждаю
   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                         Заместитель Руководителя
 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ               Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)                                            В.В.Селиверстов

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

№  13-7-2/1873  от   10.02.00

         МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ
     ДИЭТИЛСТИЛЬБЕСТРОЛА В ОБРАЗЦАХ МЯСА, ПЕЧЕНИ, МОЧИ И ФЕКАЛИЙ С
         ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ДЭС (ridascreEn® des)
         (производство фирмы Ар-Биофарм/r-biopharm, Германия)

1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения диэтилстильбестрола в мясе,
печени, моче и фекалиях с помощью тест-системы для иммунно-ферментного анализа
ridascreEn® des*.

*ridascreEn® и rida® являются зарегистрированными товарными знаками фирмы r-biopharm, Германи

2. Краткое описание методики
Пробоподготовка:          Ферментативный гидролиз (только для образцов печени и мочи)
                          Очистка методом твердофазной экстракции
Затраты времени:
                          Пробоподготовка
                          (при обработке 10-ти проб)      около 4 часов
                          Анализ (независимо от
                          количества проб, включая
                          время инкубации 15 часов)       18 часов
Предел обнаружения
(для образцов мяса и печени):                                   0.1 мкг/кг (100 ppt)

Сходимость результата анализа:                        коэффициент вариации
                                                          не хуже 10%
Извлекаемость (для образцов мочи):                           85%

Перекрестная чувствительность:
Диэтилстильбестрол                                          100.0%
Гексоэстрол                                                  22.0 %
Глюкоронид диэтилстильбестрола                               68.0 %
Диеноэстрол                                                 < 1.0 %
17бетта-эстрадиол                                           < 0.01 %

3. Общие положения
Стильбены, к группе которых относятся диэтилстильбестрол, диеноэстрол и гексоэстрол,
являются высокоэффективными синтетическими анаболическими стероидами, обладающие также
сильной эстрогенной активностью.

Было, однако, показано, что стильбены обладают выраженными канцерогенными
свойствами.

Использование стильбенов в животноводстве и птицеводстве, импорт и реализация
продуктов животного происхождения, содержащих остаточные концентрации диэтилстильбестрола
и других стильбенов, запрещены в Российской Федерации и в странах Европейского союза
(Указание Главного государственного ветеринарного инспектора от 4.10.99 № 12-7-1/900, Правила
по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных
стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, утвержденные
приказом МИНСЕЛЬХОЗПРОДА России от 18.08.99 № 604, Директивы Евросоюза 89/662/ЕЕС,
90/425/ЕЕС, 96/22/ЕС, 96/23/ЕС и др).

Для определения стильбенов используются инструментальные физико-химические методы
анализа, такие как жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и хромато-масс-
спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, предусматривают использование дорогостоящего
оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании.

В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более 
удобный иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, elisa), являющийся официальным методом 
контроля продуктов животного происхождения, принятым в странах Евросоюза (Директива 
93/257/ЕЕС).

4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила
безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств
защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения
свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы
определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие
технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные
параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие
требования.

5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами.
Планшет, входящий в состав набора ridascreEn® des, сенсибилизирован овечьими
антителами, специфичными к кроличьему иммуноглобулину igg, который, в свою очередь, получен
путем иммунизации кроликов диэтилстильбестролом. Анализ выполняется следующим образом.

Исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий антитела к диэтилстильбестролу
(кроличий igg) дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного
времени диэтилстильбестрол, содержащийся в пробе или в стандартном растворе, связывается
антителами к диэтилстильбестролу. Одновременно происходит взаимодействие овечьих антител
на поверхности планшета с антителами к диэтилстильбестролу.

После промывки в лунки планшета добавляется раствор, содержащий коньюгат
диэтилстильбестрола с ферментом, при этом молекулы коньюгата связываются антителами к
диэтилстильбестролу, сорбированными на поверхности планшета на предыдущей стадии.
Очевидно, что с молекулами коньюгата способны взаимодействовать только антитела, не
дезактивированные ранее молекулами диэтилстильбестрола.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы
коньюгата.

После промывки планшета в его лунки дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида)
и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе инкубации, при химическом
взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата,
связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные
продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой
бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом
голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм,
обратно пропорциональна концентрации диэтилстильбестрола в исследуемых образцах.

6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1. Предел обнаружения диэтилстильбестрола составляет:
• 0.2 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
• 0.1 мкг/кг в мясе и фекалиях при навеске образца 5 г
• 0.1 мкг/кг в печени при навеске образца 1 г

6.2. Диапазон определяемых концентрация диэтилстильбестрола составляет:
• 0.2 - 3.2 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
• 0.1-1.6 мкг/кг в мясе и фекалиях при навеске образца 5 г
• 0.1 - 1.6 мкг/кг в печени при навеске образца 1 г

7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
7.1. Средства измерения

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
рН-метр
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Дозаторы на 8, 20, 50, 100, 250,300 и 1000 мкл
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 50, 100 и 1000 мл исп. 2 по ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100 мл по ГОСТ 1770
Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности вместимостью 1 и 5 мл по ГОСТ 29169
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 5 и 10 мл по ГОСТ 29227
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1°С, пределы измерения 0 - 100°С
по ГОСТ 29224.

7.2. Вспомогательные устройства
Мясорубка по ГОСТ 4025
Микроизмельчитель тканей (гомогенизатор) РТ-2 или «Ультратюракс» с частотой 8000 -
24000 об/мин
Термостат с устанавливаемой температурой 37°С
Центрифуга с устанавливаемым ускорением 3000 g
Центрифужная пробирка емкостью 20-50 мл с завинчивающейся крышкой
Центрифужная пробирка на 5 мл
Устройство для испарения экстрактов, например испарители ротационные типа ИР-1М-2, В-
580, системы tcs, «Эвапорэк» и др. или лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1)
Устройство для перемешивания типа «вортекс»
Устройство для встряхивания проб (шейкер)
Устройство для твердофазной экстракции, например типа «Доркус», «Вакэлют» и др. или
разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пипетки Пастера
Пробирки П-2-10-14/23, П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Стаканы химические вместимостью 50, 100, 250 и 1000 мл по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Груша резиновая
Холодильник бытовой

7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа ridascreEn® des*   в стандартной
комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по
8 лунок), сенсибилизированный антителами к кроличьему igg          1 шт
Комплект стандартных растворов диэтилстильбестрола
в 40% водном растворе метанола со следующими
концентрациями (1 рр1=1нг/кг): 0 ppt (нулевой стандарт),
12.5 ppt, 25 ppt, 50 ppt, 100 ppt, 200 ppt, по 300 мкл           6х1 шт
Коньюгат диэтилстильбестрола с пероксидазой,
конц. (красная крышка)                                             1 шт
Антитела к диэтилстильбестролу, конц. (черная крышка)              1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида, 7мл (зеленая крышка)        1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензидин,
7 мл (голубая крышка)                                              1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты,
14 мл (желтая крышка)                                              1 шт
Буфер, для разбавления конц. растворов коньюгата
и антител, 25 мл                                                   1 шт

Колонки для твердофазной экстракции марки rida® c18*
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Глюкоронидаза/арилсульфатаза из helix promatia
Метилтретбутиловый эфир, (СНз)зСОСНз
(возможна замена метилтретбутилового эфира диэтиловым эфиром)
Петролейный эфир, температура кипения 40 - 70°С
Дихлорметан, ch2ci2
Метанол, СНзОН
Ортофосфорная кислота, НзРОз, концентрированная
Соляная кислота, hci, концентрации 1 М
Уксусная кислота, СНзСООН, концентрации 20 % вес.
Ацетат натрия, тригидрат, ch3coona x Зh2o
Гидрооксид натрия, naoh
Трис-(гидроксиметил)-аминометан (трис), (СН2oh)3cnh2
Дигидрофосфат натрия, дигидрат, nah2po4 x 2h2o
Гидрофосфат натрия, безводный, na2hpo4

Замечания по использованию и хранению тест-системы ridascreEn® des
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности
определения.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из     другого набора с
другим номером партии.

Храните набор при температуре 2-8°С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет с
силикагелем и плотно закроите пакет.

Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны,
избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.
*Поставляется 000 «СТАЙЛАБ» тел./факс (095) 265-44-05

Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не
рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена
является признаком его порчи.

В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым

стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи реагентов

8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а 
также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и
вспомогательные устройства.

8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими растворителями необходимо проводить
в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.

9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего
высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической
лаборатории, владеющего техникой иммунно-ферментного анализа и освоившего метод в
процессе стажировки.

10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
Температура воздуха             20 ± 5 °С;
Атмосферное давление            84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха               не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети               220 ± 10 В;
Частота переменного тока        50 ± 1 Гц

11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269, ГОСТ 7702.0 и согласно действующей
нормативной документации.

Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.

11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. При отсутствии
такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при
температуре 2 - 8°С, либо 5-6 месяцев при температуре - 20°С.

11.3. Приготовление вспомогательных растворов.

11.3.1. Приготовление раствора фосфорной кислоты концентрации 6М.
В химическом стакане на 50 мл взвешивают 29.4 г концентрированной ортофосфорной
кислоты. С помощью стеклянной воронки кислоту переносят в мерную колбу на 50 мл. Стакан
омывают двумя порциями дистиллированной воды по 5 мл. Смывы последовательно переносят в
мерную колбу с кислотой и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.2. Приготовление раствора гидрооксида натрия концентрации 1Н.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 4.0 г гидрооксида натрия. В стакан наливают
50 мл дистиллированной воды и перемешивают раствор до полного растворения щелочи. С
помощью стеклянной воронки раствор переносят в мерную колбу на 100 мл. Стакан омывают 
двумя порциями дистиллированной воды по 10 мл. Смывы последовательно переносят в мерную 
колбу с раствором и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.3. Приготовление ацетатного буферного раствора концентрации 0.5 М, рН 4.8
Навеску 6.8 г тригидрата ацетата натрия переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят
объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до
растворения ацетата натрия и переливают в химический стакан на 250 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят рН до 4.8 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 20 % раствор уксусной
кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 недели.

11.3.4. Приготовление ацетатного буферного раствора концентрации 0.05 М, рН 4.8
В мерную колбу на 100 мл переносят 10 мл ацетатного буферного раствора концентрации 
0.5М. Дистиллированной водой доводят объем раствора до метки. Раствор тщательно
перемешивают и переливают в химический стакан на 250 мл.

С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят рН до 4.8 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 20 % раствор уксусной
кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.5. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН 7.2
Взвешивают 7.67 г безводного гидрофосфата натрия и 2.02 г дигидрата д и гидрофосфата
натрия. Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения осадка и 
переливают в химический стакан на 1000 мл.

С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят рН до 7.2 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 6М раствор ортофосфорной
кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.6. Приготовление буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5
Навеску 0.242 г трис-(гидроксиметил)-аминометана переносят в мерную колбу на 100 мл и
доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до
растворения осадка и с помощью рН-метра измеряют значение рН. При необходимости доводят рН
до 8.5 ± 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 1М раствор соляной
кислоты. Раствор с установленным значением рН переносят в колбу на 250 мл и смешивают с 25
мл метанола.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.7. Приготовление 40% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 40 мл метанола и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.8. Приготовление 70% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 70 мл метанола и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.9. Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре-4 недели.

12. Пробоподготовка
12.1. Пробы мочи
12.1.1. Исследуемая проба мочи объемом 0.5 мл смешивается с 3 мл ацетатного
буферного раствора концентрации 0.05М (рН 4.8).

12.1.2. В смесь вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы и выдерживают раствор в
термостате при температуре 37°С в течении 3-х часов.
Гидролизат может хранится 2-3 дня при температуре 2 - 8°С, либо 3-4 недели при
температуре - 20°С.

12.1.3. Очистка пробы методом твердофазной экстракции.
12.1.3.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции, руководствуясь инструкцией
по его эксплуатации, промойте колонку rida® c18 3 мл метанола со скоростью 1 капля в секунду.
При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления воздуха на входе
в колонку используйте разовый пластиковый шприц на 5 мл.

12.1.3.2. Пропустите через колонку 2 мл буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5 со
скоростью 1 капля в секунду.

12.1.3.3. Пропустите через колонку весь объем подготовленного раствора исследуемой
пробы со скоростью 1 капля в секунду.

12.1.3.4. Промойте колонку 2 мл буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5 со
скоростью 1 капля в секунду.

12.1.3.5. Промойте колонку 3 мл 40% раствора метанола со скоростью 1 капля в секунду.
После удаления из колонки остатков жидкости, колонка высушивается в токе воздуха или азота в
течение 2-х минут.

12.1.3.6. Адсорбированные на сухой колонке вещества осторожно, со скоростью 15 капель в
минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую пробирку, объемом 10 мл.

Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться течении 3- 4 месяцев     при
температуре - 20°С.

12.1.3.7. В пробирку с элюатом добавляют 3 мл 80% раствора метанола и 4 мл
дистиллированной воды. Содержимое пробирки перемешивают.

12.1.3.8. Для анализа используют 20 мкл раствора.

12.2. Пробы мяса.
12.2.1. Исследуемые образцы мяса должны быть свободны от жира и соединительной
ткани.

12.2.2. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.

12.2.3. Навеску 5 г фарша переносят в сосуд микроизмельчителя тканей и гомогенизируют 
в течение одной минуты с 10 мл раствора фосфатного буфера, рН 7.2.

12.2.4. Навеску 3 г гомогената переносят в центрифужную пробирку на 20 - 50 мл,
снабженную завинчивающейся крышкой.

12.2.5. В центрифужную пробирку с гомогенатом добавляют 8 мл метилтретбутилового
(диэтилового) эфира и энергично встряхивают содержимое в течении 20 мин. при помощи
устройства для встряхивания проб либо вручную.

12.2.6. Центрифужную пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении
3000 g в течение 10 мин

12.2.7. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае недостаточно эффективного
разделения процедуру центрифугирования повторяют.

12.2.8. С помощью пипетки Пастера и груши эфирный слой переносят в пробирку
устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии такого устройства, в грушевидную 
колбу лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1). При заборе эфирного слоя в пипетку 
Пастера избегайте попадания в пипетку водной фазы.

12.2.9. Повторите процедуру экстракции согласно пп.12.2.5.-12.2.8.

12.2.10. Объедините эфирные экстракты и испарите их досуха в вытяжном шкафу.
Примечание: для испарения экстрактов можно использовать специализированное
устройство для испарения экстрактов, лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1), либо
водяную баню и подходящий к имеющейся центрифуге стеклянный флакон на 30 мл с
завинчивающейся крышкой, материал которой устойчив к использующимся реагентам. При
выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют с помощью
термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира - 55.5 °С, температура кипения
диэтилового эфира - 34.5°С).

12.2.11. После испарения эфирного слоя досуха в сосуд с сухим остатком (в случае
использования лабораторной установки - в грушевидную колбу) поместите 1 мл 70% раствора
метанола и тщательно омойте стенки сосуда.

12.2.12. Для обезжиривания метанольного раствора поместите в сосуд 3 мл петролейного
эфира, закройте герметичной крышкой (притертой стеклянной пробкой) и энергично встряхивайте
сосуд в течении 15 секунд.

12.2.13. Перенесите содержимое сосуда в центрифужную пробирку на 5 мл,
центрифугируйте при 3000 g в течении 5 мин (если испарение эфирного экстракта проводилось в
стеклянном флаконе, центрифугирование выполняется непосредственно в этом флаконе).

12.2.14. С помощью пипетки Пастера отберите из центрифужной пробирки (либо из
стеклянного флакона) верхний слой петролейного эфира и отбросьте его. Нижний метанольный
слой перенесите в сосуд, в котором проводилось испарение эфирного экстракта и выпарите
раствор досуха, руководствуясь п.12.2.10 (температура кипения метанола - 64.5 °С).

12.2.15. Поместите в сосуд 1 мл дихлорметана, растворите сухой остаток, тщательно
омывая стенки сосуда. Поместите в сосуд 3 мл 1Н раствора гидрооксида натрия, закройте
герметичной крышкой и энергично встряхивайте в течение 5 мин.

12.2.16. Перенесите содержимое сосуда в центрифужную пробирку на 5 мл,
центрифугируйте при 3000 g в течении 5 мин (если испарение метанольного раствора по п. 12.2.14
проводилось в стеклянном флаконе, центрифугирование выполняется непосредственно в этом
флаконе).

12.2.17. С помощью пипетки Пастера отберите верхний щелочной слой и перенесите его в
другую чистую пробирку.

12.2.18. С помощью дозатора добавьте в пробирку с щелочным экстрактом 300 мкл 6М
раствора фосфорной кислоты.

12.2.19. Следуйте процедуре очистки пробы методом твердофазной экстракции, описанной
в разделе 12.1.3.

12.3. Пробы фекалий.
12.3.1. Навеску 5 г пробы фекалий переносят в сосуд микроизмельчителя тканей и
гомогенизируют с 10 мл дистиллированной воды.

12.3.2. Далее следуют процедуре пробоподготовки, начиная с раздела 12.2.4.

12.4. Пробы печени.
12.4.1. Навеску 1 г пробы печени переносят в сосуд микроизмельчителя тканей и
гомогенизируют с 2 мл 0.5М раствора ацетатного буфера, рН 4.8.

12.4.2. В смесь вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы и выдерживают раствор в
термостате при температуре 37°С в течении 3-х часов.
Гидролизат может хранится 2-3 дня при температуре 2 - 8°С, либо 3- 4 недели при
температуре - 20°С.

12.4.3. Далее следуют процедуре пробоподготовки, начиная с раздела 12.2.4.

13. Порядок проведения измерений
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы
ridascreEn® des

Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до
комнатной (30 - 40 минут до температуры 18 - 20 °С).

Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры
2-8°С.

В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета.

Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа существенно зависит от
тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной
далее процедуре отмывки планшета.

На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.

13.2. Подготовка к измерениям

13.2.1. Приготовление препарата коньюгата
Коньюгат диэтилстильбестрола с ферментом (флакон с красной крышкой) поставляется в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат коньюгата имеет ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата коньюгата осторожно встряхните содержимое
флакона. Для приготовления готового к использованию препарата коньюгата разбавьте
концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении
1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата коньюгата с
2 мл буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений).

13.2.2. Приготовление препарата антител
Антитела к диэтилстильбестролу (флакон с черной крышкой) поставляются в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат антител имеет ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата антител осторожно встряхните содержимое
флакона. Для приготовления готового к использованию препарата антител разбавьте
концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении
1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата антител с 2
мл буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)

13.2.3. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество
стрипов.

Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с
силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 -
8°С.

13.2.4. Стандартные растворы
Стандартные растворы диэтилстильбестрола поставляются готовыми для использования в
следующих концентрациях:
Стандарт 1                                              0 ppt
Стандарт 2                                           12.5 ppt
Стандарт 3                                             25 ppt
Стандарт 4                                             50 ppt
Стандарт 5                                            100 ppt
Стандарт  6                                           200 ppt
Примечание: 1 ppt = 1 нг/кг

13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех
запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты лунок, 
предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример 
формы записи приведен на Рис.1.

Рисунок 1. Пример формы записи координат лунок перед выполнением анализа
                           (С-стандарты, П-пробы).

13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 20 мкл стандартных и исследуемых растворов в
соответствующие пары лунок.

13.3.3. С помощью дозатора добавьте в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного
препарата антител. При выполнении этой и последующих операций предпочтительно
использование 8-ми канального дозатора (при этом раствор удобно отбирать из специальной
ванночки или из чашки Петри). Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте
раствор в лунках и оставьте планшет на ночь для инкубации при температуре 2 - 8 °С (в бытовом
холодильнике).

13.3.4. Вылейте жидкость из лунок и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в
лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной
бумагой. С помощью дозатора наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и вылейте воду.
Выбейте капельки воды как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок водой еще один
раз.

13.3.5. Добавьте по 50 мкл разбавленного препарата коньюгата в каждую лунку и
инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.

13.3.6. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по
столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью дозатора наполните лунки 250 мкл
дистиллированной воды и вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше. Повторите
процедуру промывки лунок водой еще два раза.

13.3.7. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую лунку. Тщательно
перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте.

13.3.8. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешайте. В
течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой
лунке при 450 нм.

14. Обработка результатов исследования
14.1. Вычисление концентрации диэтилстильбестрола в исследуемых образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат
измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с
нулевым стандартом, то есть:

Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
---------—————————————————————————   x 100 = % поглощения
Средняя оптическая плотность лунки
с нулевым стандартом

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и
соответствующим значениям концентрации диэтилстильбестрола в нг/кг (ppt) строится
калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна
быть почти линейна в диапазоне 25 - 200 нг/кг (см. Рис. 2).

Концентрация диэтилстильбестрола в исследуемых растворах в нг/кг (ppt) считывается по
калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному
для этих растворов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать
специализированное программное обеспечение, например, rida®soft* . При компьютерной
обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного
обеспечения.

Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию диэтилстильбестрола в
исследуемой исходной пробе, величину концентрации диэтилстильбестрола, полученную по
калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При
выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой
фактор разбавления принимает следующие значения:
Моча                                                 16
Мясо, фекалии, печень                                 8

 



Концентрация, нг/кг
Рисунок2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы ridascreEn® des

*Поставляется 000 «СТАЙЛАБ» тел./факс (095) 265-44-05

ПРИМЕЧАНИЕ:  При положительном результате определения исследование образцов,
показавших положительный результат, повторяют. При повторном 
исследовании образцов рекомендуется выполнить оценку коэффициента 
извлечения с помощью внесения в образец добавки диэтилстильбестрола на 
стадии пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см.Приложение2).

15. Интерпретация результатов исследования
Использование диэтилстильбестрола в животноводстве и птицеводстве,   импорт и
реализация продукции животного происхождения, содержащей остаточные количества
диэтилстильбестрола, полностью запрещены как в странах Евросоюза так и в Российской
Федерации.

Чувствительность  иммуно-ферментного  метода  анализа   позволяет  определять
концентрации диэтилстильбестрола в мясе на уровне 0.1 мкг/кг и более.
Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля при положительном
результате определения проводят подтверждающий анализ независимым методом (используется,
например,  хроматомасс-спектрометрия,  высокоэффективная жидкостная  хроматография),
обладающим худшей чувствительностью,  результат определения  интерпретируют как
положительный если величина найденной концентрации больше предела обнаружения
независимого метода анализа.

Предел   обнаружения   хромато-масс-спектрометрического   метода   определения
диэтилстильбестрола составляет 1 мкг/кг.

Пробы с найденной концентрацией диэтилстильбестрола в диапазоне от 0.1 мкг/кг до 1
мкг/кг рассматривают как «подозрительные».