МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Утверждаю
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
Заместитель Руководителя
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)
В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
№ 13-7-2/1871 от 10.02.2000
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ
ЭТИНИЛЭСТРАДИОЛА В ОБРАЗЦАХ
МЯСА С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
РИДАСКРИН ЭТИНИЛЭСТРАДИОЛ (ridascreEn®
ethinylostradiol)
(производство фирмы
Ар-Биофарм/r-biopharm, Германия)
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения
этинилэстрадиола в мясе с
помощью тест-системы для иммунно-ферментного анализа
ridascreEn® ethinylostradiol".
2. Краткое описание методики
Пробоподготовка: Очистка методом твердофазной
экстракции
Затраты времени:
Пробоподготовка
(при обработке 10-ти проб)
около 1-го часа
Анализ (независимо от количества проб) 3
часа
Предел обнаружения:
0.1 мкг/кг (100 ppt)
Сходимость результата анализа:
коэффициент вариации
не хуже 10%
Перекрестная чувствительность:
этинилэстрадиол
100.0%
эстрадиол-17(3
0.7%
тренболон
0.03 %
нортестостерон
0.005 %
эстрон
0.02 %
эстрадиол-17a
< 0.001%
тестостерон
< 0.001%
диэтилстильбестрол
< 0.001%
прогестерон
< 0.001%
*ridascreEn® и rida® являются зарегистрированными товарными знаками фирмы r-biopharm, Германи
3. Общие положения
Этинмлэстрадиол являются синтетическим гормоноподобным
веществом, обладающим
эстрогенной активностью.
Использование этинилэстрадиола в животноводстве и птицеводстве
приводит к его
накоплению в продуктах животного происхождения и запрещено
как в Российской Федерации так
и в странах Европейского союза (Указание Главного государственного
ветеринарного инспектора
от 4.10.99 № 12-7-1/900, Правила
по организации государственного ветеринарного надзора за
содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков
в продукции животного
происхождения, утвержденные приказом УИНСЕЛЬХОЗПРОДА
России от 18.08.99 Ш 604,
Директивы Евросоюза 89/662/ЕЕС, 90/425/ЕЕС, 96/22/ЕС,
96/23/ЕС и др).
Для определения этинилэстрадиола используются инструментальные
физико-химические
методы анализа, такие как жидкостная хроматография высокого
давления (ВЭЖХ) и хромато-
масс-спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы,
однако, предусматривают использование
дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном
обслуживании.
В последнее время в рутинной лабораторной практике широко
применяется более
удобный иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, elisa),
являющийся официальным методом
контроля продуктов животного происхождения, принятым
в странах Евросоюза (Директива
93/257/ЕЕС).
4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация
и общие правила
безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая
искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования
и номенклатура
средств защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная.
Цилиндры, мензурки, колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Уясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические
методы определения
свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые.
Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органопептические
методы
определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и
образцовые. Общие
технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные.
Типы, основные
параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки
с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные.
Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки
градуированные. Общие
требования.
5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов
с антителами.
Планшет, входящий в состав набора ridascreEn® ethinylostradiol,
сенсибилизирован
овечьими антителами, специфичными к кроличьему иммуноглобулину
igg, который, в свою
очередь, получен путем иммунизации кроликов этинилэстрадиолом.
Анализ выполняется
следующим образом.
Исследуемые (стандартные) образцы, раствор, содержащий
антитела к этинилэстрадиолу
(кроличий igg) и раствор, содержащий коньюгат этинилэстрадиола
с ферментом, дозируются в
лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного
времени молекулы
этинилэстрадиола, содержащегося в пробе или в стандартном
растворе и молекулы коньюгата
этинилэстрадиола с ферментом, конкурируя между собой,
связываются антителами к
этинилэстрадиолу в объеме раствора. Одновременно происходит
иммуносорбция антител к
этинилэстрадиолу овечьими антителами на поверхности планшета.
На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются
свободные молекулы
коньюгата этанилэстрадиола с ферментом.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор
субстрата (пероксид
карбаммда) и раствор хромогена (тетраметипбензидин).
В процессе инкубации, при химическом
взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный
фрагмент молекулы коньюгата,
связанной на поверхности лунки, выступает в качестве
катализатора, образуются окрашенные
продукты реакции. Через определенное время развития цветной
реакции, в результате которой
бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки
добавляется стоп-реагент, при этом
голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре
(ридере) при 450 нм,
обратно пропорциональна концентрации этанилэстрадиола
в исследуемых образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1. Предел обнаружения этанилэстрадиола в мясе составляет:
0.1 мкг/кг при навеске образца Юг
6.2. Диапазон определяемых концентрация этанилэстрадиола
в мясе составляет:
0.1 - 25.6 мкг/кг при навеске образца Юг
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы
и материалы.
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности
с наибольшим
пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
рН-метр
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Дозаторы на 20, 50, 100, 200 и 1000 мкл
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 50, 100
и 1000 мл исп. 2 по ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50
и 100 мл по ГОСТ 1770
Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности вместимостью
5 мл по ГОСТ 29169
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью
5 и 10 УЛ по ГОСТ 29227
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1°С,
пределы измерения 0 -
100°С по ГОСТ 29224.
7.2. Вспомогательные устройства
Мясорубка по ГОСТ 4025
Центрифуга с устанавливаемым ускорением 3000 д и возможностью
охлаждения
(желательно)
Центрифужная пробирка на 10-15 мл с завинчивающейся крышкой
Устройство для испарения экстрактов, например испарители
ротационные типа ИР-1М-2,
В-580, системы tcs, «Эвапорэк» и др. или лабораторный
микроиспаритель (см.
Приложение 1)
Устройство для перемешивания типа «вортекс»
Устройство для встряхивания проб
Устройство для твердофазной экстракции, например типа
«Доркус», «Вакэлют» и др. ш
разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пипетки Пастера
Пробирки П-2-10-14/23, П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными
пробками
Колба коническая со шлифом и притертой пробкой типа КН-1-50-14/23
по ТУ 92-891.029-91
Стаканы химические вместимостью 50, 100, 250 и 1000 мл
по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Груша резиновая
Холодильник бытовой
7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа
r1dascreEn® etninylostradiol в
стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по
8 лунок),
сенсибилизированный антителами к кроличьему igg
1 шт
Комплект стандартных растворов этинилэстрадиола
в 40% водном растворе метанола со следующими
концентрациями (1 рр1=1нг/кг): 0 ppt (нулевой стандарт),
50 ppt, 200 ppt, 800 ppt, 3200 ppt, 12800 ppt, по 300
мкл 6
х 1 шт
Коньюгат этинилэстрадиола с пероксидазой,
конц. (красная крышка)
1 шт
Антитела к этинилэстрадиолу,
конц. (черная крышка)
1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида,
7 мл (зеленая крышка)
1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензмдин,
7 мл (голубая крышка)
1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты,
14 мл (желтая крышка)
1 шт
Буфер, для разбавления конц. растворов коныюгата
и антител, 50 мл
1 шт
Колонки для твердофазной экстракции марки rida® c18*
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Метилтретбутиловый эфир, (СНз)зСОСНз
(возможна замена метилтретбутилового эфира диэтиловым
эфиром)
Метанол, СНзОН
Ортофосфорная кислота, НзРОз, концентрированная
Дигидрофосфат натрия, дигмдрат, nahzpcxt x 2h20
Гидрофосфат натрия, безводный, МагНР04
Замечания по использованию и хранению тест-системы
ridascreEn® ethinylostradiol
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере
чувствительности
определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами
из другого набора с
другим номером партии.
Храните набор при температуре 2-8°С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ
НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте
их в фольгированный пакет с
силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.
Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны,
избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы
с растворами.
Признаки порчи реагентов. В случае окрашивания раствора
хромогена не
рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание
раствора хромогена
является признаком его порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной
в лунке с нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком
порчи реагентов.
8. Требования безопасности.
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования
техники безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007,
требования пожарной безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019, а также
требования, указанные в технической документации на весы,
спектрофотометр и
вспомогательные устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений,
должно быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими
растворителями необходимо проводить
в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.
9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
специалиста, имеющего
высшее или среднее специальное образование, владеющего
техникой иммунно-ферментного
анализа и освоившего метод в процессе стажировки.
10.Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены
следующие условия:
Температура воздуха
20 ± 10 °С;
Атмосферное давление
84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха
не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети
220 ± 10 В;
Частота переменного тока
50 ± 1 Гц
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269 и ГОСТ 7702.0
и согласно действующей
нормативной документации.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.
11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в
лабораторию. При отсутствии
такой возможности допускается хранение образцов не более
чем 2 суток с момента отбора при
температуре 2 - 8°С, либо 5-6 месяцев при температуре
- 20°С.
11.3. Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление раствора фосфорной кислоты концентрации
1М.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 9.8г концентрированной
ортофосфорной
кислоты. С помощью стеклянной воронки кислоту переносят
в мерную колбу на 100 мл. Стакан
омывают двумя порциями дистиллированной воды по 10 мл.
Смывы последовательно переносят
в мерную колбу с кислотой и разбавляют раствор дистиллированной
водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4
недели.
11.3.2. Приготовление 0.067 М фосфатного буферного раствора,
рН 7.2
Взвешивают 7.67 г безводного гидрофосфата натрия, 2.02
г дигидрата дигидрофосфата
натрия и 8.7 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную
колбу на 1000 мл и доводят объем
раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно
перемешивают до растворения
осадка и переливают в химический стакан на 1000 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости
доводят рН до 7.2 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя
раствор ортофосфорной
кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
11.3.3. Приготовление 0.02 М фосфатного буферного раствора,
рН 7.2
Взвешивают 2.3 г безводного гидрофосфата натрия, 0.62
г дигидрата дигидрофосфата
натрия и 9.0 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную
колбу на 1000 мл и доводят объем
раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно
перемешивают до растворения
осадка и переливают в химический стакан на 1000 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости
доводят рН до 7.2 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя
раствор ортофосфорной
кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
11.3.4. Приготовление 40% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 40 мл метанола и доводят
объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4
недели.
11.3.5. Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят
объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4
недели.
12. Пробоподготовка
12.1. Пробы мяса.
12.1.1. Исследуемые образцы мяса должны быть свободны
от жира и соединительной
ткани.
12.1.2. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.
12.1.3. Навеску 10 г фарша и 10 мл 0.067 М фосфатного
буферного раствора (рН 7.2)
переносят в коническую колбу на 50 мл, закрывают колбу
притертой пробкой и энергично
встряхивают в течение 5-ти минут.
12.1.4. Навеску 2 г гомогената переносят в центрифужную
пробирку на 10 - 15 мл,
снабженную завинчивающейся крышкой.
12.1.5. В центрифужную пробирку с гомогенатом вносят 5
мл метилтретбутилового
(диэтилового) эфира и энергично встряхивают содержимое
в течении 20 мин при помощи
устройства для встряхивания проб либо вручную.
12.1.6. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют
при ускорении 3000 д и
температуре 10 - 15°С в течение 10 мин.
12.1.7. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае
недостаточно эффективного
разделения процедуру центрифугирования повторяют.
12.1.8. С помощью пипетки Пастера и груши эфирный слой
переносят в пробирку
устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии
такого устройства, в грушевидную
колбу лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1).
При заборе эфирного слоя в пипетку
Пастера избегайте попадания в пипетку водной фазы.
12.1.9. Повторите процедуру экстракции согласно пп.12.1.5.-12.1.8.
12.1.10. Объедините эфирные экстракты и испарите их досуха
в вытяжном шкафу.
Примечание: для испарения экстрактов можно использовать
специализированное
устройство для испарения экстрактов, лабораторный микроиспаритель
(см. Приложение 1), либо
водяную баню и подходящий к имеющейся центрифуге стеклянный
флакон на 20 - 30 мл с
завинчивающейся крышкой, материал которой устойчив к
использующимся реагентам. При
выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения
контролируют с помощью
термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира
- 55.5 °С, температура кипения
диэтилового эфира - 34.5°С).
12.1.11. После испарения эфирного слоя досуха в пробирку
(флакон, колбу) с сухим
остатком поместите 1 мл 80% раствора метанола и тщательно
омойте стенки пробирки (флакона,
колбы).
12.1.12. Смешайте метанольный раствор и 2 мл 0.02 w фосфатного
буферного раствора.
Далее раствор очищается методом твердофазной экстракции.
12.1.13. Очистка методом твердофазной экстракции.
12.1.13.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции,
руководствуясь
инструкцией по его эксплуатации, промойте колонку rida®
c18 3 мл метанола со скоростью 1
капля в секунду. При отсутствии устройства для твердофазной
экстракции для создания давления
воздуха на входе в колонку используйте разовый пластиковый
шприц на 5 мл.
12.1.13.2. Пропустите через колонку 2 мл 0.02 М фосфатного
буферного раствора со
скоростью 1 капля в секунду.
12.1.13.3. Пропустите через колонку весь объем подготовленного
раствора исследуемой
пробы со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.13.4. Промойте колонку 2 мл 40% раствора метанола со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.13.5. Удалите из колонки остатки жидкости и высушите
колонку, продувая ее воздухом
или азотом в течение 3-х минут.
12.1.13.6. Адсорбированные на колонке вещества осторожно,
со скоростью 15 капель в
минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую
пробирку, объемом 5 мл.
12.1.13.7. В пробирку с элюатом добавляют 1 мл дистиллированной
воды. Содержимое
пробирки перемешивают.
12.1.13.8. Для анализа используют 20 мкл раствора.
Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться
течении 3-4 месяцев при
температуре - 20°С или 2 недели при температуре 2 - 8
°С.
Примечание: процедура пробоподготовки, описанная
в разделе 12.1 методики может быть
также использована и при определении тренболона, метилтестостерона,
19-
нортестостерона, тестостерона и эстрадиола-17(3
в пробах мяса с помощью тест-систем
ridascreEn® trenbolon, ridascreEn®
methyltestosteron, ridascreEn® 19-nortestosteron,
ridascreEn® testosteron и ridascreEn® 17(3-ostradiol.
13. Порядок проведения измерений
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений
с помощью тест-системы
ridascreEn® ethinylostradiol.
Перед использованием тест-системы доведите
температуру всех реагентов до
комнатной.
Немедленно после использования охладите
все оставшиеся реагенты до температуры 2
8°С.
В процессе выполнения анализа не допускайте
высыхания лунок планшета.
Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного
анализа существенно зависит
от тщательности отмывки планшета в процессе анализа.
Внимательно следуйте
описанной далее процедуре отмывки планшета.
На всех стадиях инкубации избегайте воздействия
прямого солнечного света.
13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Приготовление препарата коньюгата
Коньюгат этинилэстрадиола с ферментом (флакон с красной
крышкой) поставляется в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат
коньюгата имеет ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое
количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата коньюгата
осторожно встряхните
содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию
препарата коньюгата
разбавьте концентрированный препарат буферным раствором,
имеющимся в комплекте набора, в
отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте
200 мкл концентрированного препарата
коньюгата с 2 мл буфера - данного разведения достаточно
для 4-х стрипов, то есть для 32
определений)
13.2.2. Приготовление препарата антител
Антитела к этмнмлэстрадиолу (флакон с черной крышкой)
поставляются в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат
антител имеет ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только
необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата антител
осторожно встряхните содержимое
флакона. Для приготовления готового к использованию препарата
антител разбавьте
концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся
в комплекте набора, в
отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте
200 мкл концентрированного препарата
антител с 2 мл буфера - данного разведения достаточно
для 4-х стрипов, то есть для 32
определений)
13.2.3. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный
антителами
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь
необходимое количество
стрмпов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный
пакет с силикагелеи
(осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на
хранение при температуре 2=8 °С.
13.2.4. Стандартные растворы
Стандартные растворы этинилэстрадиола поставляются готовыми
для использования в
следующих концентрациях:
Стандарт 1
0 ppt
Стандарт 2
50 ppt
Стандарт 3
200 ppt
Стандарт 4
800 ppt
Стандарт 5
3200 ppt
Стандарт 6
12800 ppt
Примечание: 1ppt = 1 нг/кг
13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве,
необходимом для выполнения всех
ированных определений в дупликате (по 2 раза). Запишите
координаты лунок,
предназначенных для стандартных растворов и подготовленных
исследуемых растворов. Припер
формы записи приведен на Рис. 1.
| С1 | С1 | ПЗ | ПЗ | П11 | П11 | П19 | П19 | П27 | П27 | П35 | П35 |
| С2 | С2 | П4 | П4 | П12 | П12 | П20 | П20 | П28 | П28 | П36 | П36 |
| СЗ | СЗ | П5 | П5 | П13 | П13 | П21 | П21 | П29 | П29 | П37 | П37 |
| С4 | С4 | П6 | П6 | П14 | П14 | П22 | П22 | ПЗО | ПЗО | П38 | П38 |
| С5 | С5 | П7 | П7 | П15 | П15 | П23 | П23 | П31 | П31 | П39 | П39 |
| С6 | С6 | П8 | П8 | П16 | П16 | П24 | П24 | П32 | П32 | П49 | П49 |
| П1 | П1 | П9 | П9 | П17 | П17 | П25 | П25 | ПЗЗ | ПЗЗ | П41 | П41 |
| П2 | П2 | П10 | П10 | П18 | П18 | П26 | П26 | П34 | П34 | П42 | П42 |
Рисунок 1. Пример формы
записи координат лунок перед выполнением
анализа (С-стандарты, П-пробы).
13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл разбавленного
препарата коньюгата в
каждую лунку и по 20 мкл стандартных и исследуемых растворов
в соответствующие пары лунок.
При дозировании раствора коньюгата и выполнении последующих
операций предпочтительно
использование 8-ми канального дозатора (при этом раствор
удобно отбирать из специальной
ванночки или из чашки Петри).
13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного
препарата антител.
Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте
раствор в лунках и оставьте
планшет на инкубацию в течение 2-х часов при комнатной
температуре.
13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета
и тщательно выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного
постукивания рамки с лунками по
столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните каждую
лунку 200 мкл дистиллированной
воды и вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано
выше. Повторите процедуру промывки
лунок водой еще два раза.
13.3.5. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена
в каждую лунку. Тщательно
перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в
течение 30 минут в темноте.
13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента
и хорошо перемешайте. В
течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте
оптическую плотность в каждой
лунке при 450 нм.
14. Обработка результатов исследования
14.1. Вычисление концентрации этинилэстрадиола в исследуемых
образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках
со стандартными и
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической
плотности, измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается
на 100. Таким образом, результат
измерения оптической плотности выражается в процентах
от оптической плотности лунки с
нулевым стандартом, то есть:
Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
-----------------------------------
х 100 = % поглощения
Средняя оптическая плотность лунки
с нулевым стандартом
По величинам относительного поглощения, вычисленным для
стандартных растворов и
соответствующим значениям концентрации этинилэстрадиола
в нг/кг (ppt) строится калибровочная
кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная
кривая должна быть почти
линейна в диапазоне 50 - 3200 нг/кг (см. Рис. 2).
Концентрация этинилэстрадиола в исследуемых растворах
в нг/кг (ppt) считывается по
калибровочной кривой соответственно
относительному поглощению, измеренному и
вычисленному для этих растворов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется
использовать
специализированное программное обеспечение, например,
rida®soft*. При компьютерной
обработке результатов следует руководствоваться инструкцией
по использованию программного
обеспечения.
Поставляется 000 «СТАЙЛАБ» тел./факс (095) 265-44-05
Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию этинилэстрадиола
в
исследуемой исходной пробе, величину концентрации этинилэстрадиола,
полученную по
калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий
фактор разбавления. При
выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии
с приведенной методикой
фактор разбавления принимает следующие значения:
Мясо 2
Оптическая плотность,
(%)
Концентрация, нг/кг
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы
ridascreEn® ethylnylostradiol
ПРИМЕЧАНИЕ: При положительном результате определения исследование
образцов,
показавших положительный результат, повторяют. При повторном
исследовании образцов рекомендуется выполнить оценку коэффициента
извлечения с помощью внесения в образец добавки этинилэстрадиола на
стадии пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см.
Приложение 2).
15. Интерпритация результатов исследования
Использование этинилэстрадиола в животноводстве и птицеводстве,
импорт и
ация продукции животного происхождения, содержащей остаточные
количества
этинилэстрадиола, полностью запрещены как в странах Евросоюза
так и в Российской Федерации.
Чувствительность иммуно-ферментного метода
анализа позволяет определять
концентрации этинилэстрадиопа в мясе на уровне 0.1 мкг/кг
и более.
Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля
при положительном
результате определения проводят подтверждающий анализ
независимым методом
(используется, например, хроматомасс-спектрометрия,
высокоэффективная жидкостная
хроматография), обладающим худшей
чувствительностью, результат определения
интерпретируют как положительный если величина найденной
концентрации больше предела
обнаружения независимого метода анализа.
Предел обнаружения хромато-масс-спектрометрического
метода определения
этинипэстрадиола составляет 2 мкг/кг.
Пробы с найденной концентрацией этинилэстрадиола в диапазоне
от 0.1 мкг/кг до 2 мкг/кг
рассматривают как «подозрительные».
.gif){kind=small}
.gif){kind=small}