Министерство
сельского хозяйства Утверждаю
и продовольствия Заместитель руководителя
Российского хозяйства Департамент ветеринарии
(Минсельхозпрод России) В.В.Селиверстов
Департамент ветеринарии
10.02.2000г. № 13-7-2/1872
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТИЛ-
ТЕСТОСТЕРОНА В ОБРАЗЦАХ МЯСА И МОЧИ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
РИДАСКРИН МЕТИЛТЕСТОСТЕРОН (ridascreEn® methyltestosteron)
(производство фирмы Ар-Биофарм/r-biopharm, Германия)
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения
метилтестостерона в мясе и моче с помощью тест-системы для
иммунно-ферментного анализа ridascreEn® methyltestosteron*.
* ridascreEn® и rida® являются зарегистрированными товарными
знаками фирмы r-biopharm, Германия.
2. Краткое описание методики
Пробоподготовка:Ферментативный гидролиз (только для образцов мочи)
Очистка методом твердофазной экстракции
Затраты времени:
Пробоподготовка
(при обработке 10-ти проб) около 1-го часа
Анализ(независимо от
количества проб) 1 час
+
инкубация
в
течение
ночи
Предел обнаружения:
для образцов мяса: 0.1 мкг/кг (100
ppt)
для образцов мочи: 0.2 мкг/кг (200
ppt)
Сходимость результата анализа: коэффициент вариации
не хуже 12%
Извлекаемость (для образцов мочи): 90%
Перекрестная чувствительность:
Метилтестостерон 100.0%
тестостерон
40.0%
17альфа-метиландростан-17бетта-ол-3-он
28.0%
1,4-андростадиен-17альфа-метил-17бетта-ол-3-он 26.3%
1-дегидротестостерон 16.2%
5альфа-андростан-17бетта-ол-3-он 13.1%
5альфа-андростан-2-окса-17альфа-метил-17бетта-ол-3-он
4.6 %
19-нортестостерон 3.2%
3. Общие положения
Метилтестостерон являются синтетическим анаболическим
стероидом, обладающим, подобно тестостерону, андрогенной
активностью.
Использование метилтестостерона в животноводстве и
птицеводстве, импорт и реализация продуктов животного
происхождения, содержащих остаточные концентрации
метилтестостерона, запрещены в Российской Федерации и в странах
Европейского союза
(Указание Главного государственного ветеринарного инспектора от
4.10.99 № 12-7-1/900, Правила по организации
государственного
ветеринарного надзора за содержанием гормональных
стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного
происхождения, утвержденные приказом МИНСЕЛЬХОЗПРОДА России от
18.08.99 № 604, Директивы Евросоюза 89/662/ЕЕС, 90/425/ЕЕС,
96/22/ЕС, 96/23/ЕС и др).
Для определения метилтестостерона используются
инструментальные физико-химические методы анализа, такие как
жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и хромато-масс-
спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, предусматривают
использование дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высоко
квалифицированном обслуживании.
В последнее время в рутинной лабораторной практике широко
применяется более удобный иммунно-ферментный метод анализа (ИФА,
elisa), являющийся официальным методом контроля продуктов
животного происхождения, принятым в странах Евросоюза
(Директива 93/257/ЕЕС).
4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация
и общие правила безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность.
Электростатическая искробезопасность. Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования
и номенклатура средств защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная.
Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов.
Органолептические методы определения свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые.
Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов.
Органолептические методы определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и
образцовые. Общие технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные
стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с
одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные.
Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки
градуированные. Общие требования.
5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие
антигенов с антителами.
Планшет, входящий в состав набора ridascreEn®
methyltestosteron, сенсибилизирован овечьими антителами,
специфичными к кроличьему иммуноглобулину igg, который, в
свою очередь, получен путем иммунизации кроликов
метилтестостероном. Анализ выполняется следующим образом.
Исследуемые (стандартные) образцы, раствор, содержащий
антитела к метилтестостерону (кроличий igg) и раствор,
содержащий коньюгат метилтестостерона с ферментом,
дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в
течение определенного времени молекулы метилтестостерона,
содержащегося в пробе или в стандартном растворе и молекулы
коньюгата метилтестостерона с ферментом, конкурируя между
собой, связываются антителами к метилтестостерону в объеме
раствора. Одновременно происходит иммуносорбция антител к
метилтестостерону овечьими антителами на поверхности
планшета.
На последующей стадии промывки из лунок планшета
удаляются свободные молекулы коньюгата метилтестостерона с
ферментом.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор
субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена
(тетраметилбензидин). В процессе инкубации, при химическом
взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный
фрагмент молекулы коньюгата,
связанной на поверхности лунки, выступает в качестве
катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. Через
определенное время развития цветной реакции, в результате
которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в
лунки добавляется стоп-реагент, при этом
голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном
фотометре при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации
метилтестостерона в исследуемых образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1. Предел обнаружения метилтестостерона составляет:
• 0.2 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
• 0.1 мкг/кг в мясе при навеске образца 10 г
6.2. Диапазон определяемых концентраций
метилтестостерона составляет:
• 0.2 - 16.2 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
• 0.1-8.1 мкг/кг в мясе при навеске образца 10 г
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы
и материалы
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса
точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по
ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
рН-метр
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Дозаторы на 20, 50, 100, 200 и 1000 мкл
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 50, 100
и 1000 мл исп.2 по ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и
100 мл по ГОСТ 1770
Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности
вместимостью 5 мл по ГОСТ 29169
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 5
и 10 мл по ГОСТ 29227
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1°С,
пределы измерения 0 - 100°С по ГОСТ 29224.
7.2. Вспомогательные устройства
Мясорубка по ГОСТ 4025
Центрифуга с устанавливаемым ускорением 3000 g и
возможностью охлаждения (желательно)
Центрифужная пробирка на 10-15 мл с завинчивающейся крышкой
Устройство для испарения экстрактов, например испарители
ротационные типа ИР-1М-2, В-580, системы tcs, “Эвапорэк”
и др. или лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1)
Устройство для перемешивания типа “вортекс”
Устройство для встряхивания проб
Устройство для твердофазной экстракции, например типа
“Доркус”,“Вакэлют”и др. или разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пипетки Пастера
Пробирки П-2-10-14/23, П-2 -5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Колба коническая со шлифом и притертой пробкой типа КН-1-50-
14/2 по ТУ 92-891.029-91
Стаканы химические вместимостью 50, 100, 250 и 1000 мл по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Груша резиновая
Холодильник бытовой
7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа ridascreEn®
methyltestosteron* в стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8
лунок),
сенсибилизированный антителами к кроличьему igg 1 шт
Комплект стандартных растворов метилтестостерона
в 40% водном растворе метанола со следующими концентрациями
(1 рр1=1нг/кг):0 ppt (нулевой стандарт), 50 ppt, 150 ppt,
450 ppt, 1350 ppt, 4050 ppt, по 1 мл 6 х 1 шт
Коньюгат метилтестостерона с пероксидазой,
конц. (красная крышка) 1 шт
Антитела к метилтестостерону,
конц. (черная крышка) 1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида,
7 мл (зеленая крышка) 1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензидин,
7 мл (голубая крышка) 1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты,
14 мл (желтая крышка) 1 шт
Буфер, для разбавления конц. растворов
коньюгата и антител, 20 мл 1 шт
Колонки для твердофазной экстракции марки rida® c18*
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Глюкоронидаза/арилсульфатаза из helix promatia* (только
при исследованиях проб мочи)
Метилтретбутиловый эфир, (СНз)3СОСН3
(возможна замена метилтретбутилового эфира диэтиловым
эфиром)
Метанол, СН3ОН
Ортофосфорная кислота, НзРОз, концентрированная
Соляная кислота, hci, концентрации 1 М
Уксусная кислота, СНзСООН, концентрации 20 % вес.
Ацетат натрия, тригидрат, СН3СООМа х ЗН2О
Трис-(гидроксиметил)-аминометан (трис), (ci2oh)3 cnh2
Дигидрофосфат натрия, дигидрат, nah2p04 x 2h20
Гидрофосфат натрия, безводный, na2hp04
Замечания по использованию и хранению тест-системы
ridascreEn® methyltestosteron
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере
чувствительности определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из
другого набора с другим номером партии.
Храните набор при температуре 2 - 8 °С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в
фольгированный пакет с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.
Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена
светочувствительны.
Избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.
Признаки порчи реагентов: В случав окрашивания раствора
хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание
раствора хромогена является признаком его порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с
нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком
порчи реагентов.
8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования
техники безопасности при работе с химическими реактивами
по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018
и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019,
а также требования, указанные в технической документации на весы,
спектрофотометр и вспомогательные устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений,
должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими
растворителями необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием
резиновых перчаток.
9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование
или опыт работы в химической лаборатории, владеющего техникой
иммунно-ферментного анализа и освоившего метод в процессе стажировки.
10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены
следующие условия:
Температура воздуха 20 ± 5 °С;
Атмосферное давление 84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт.ст.);
Влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети 220 ± 10 В;
Частота переменного тока 50 ± 1 Гц
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269 и ГОСТ 7702.0 и
согласно действующей нормативной документации.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.
11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в
лабораторию. При отсутствии такой возможности допускается
хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при
температуре 2 - 8°С, либо 5-6 месяцев при температуре - 20°С.
11.3. Приготовление вспомогательных растворов,
11.3.1. Приготовление раствора фосфорной кислоты концентрации 1М.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 9.8г концентрированной
ортофосфорной кислоты. С помощью стеклянной воронки кислоту переносят в
мерную колбу на 100 мл. Стакан омывают двумя порциями дистиллированной
воды по 10 мл. Смывы последовательно переносят в мерную колбу
с кислотой и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.
11.3.2. Приготовление ацетатного буферного раствора
концентрации 0.05 М, рН 4.8
Навеску 0.68 г тригидрата ацетата натрия переносят в мерную
колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
Раствор тщательно перемешивают до растворения ацетата натрия и переливают
в химический стакан на 250 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости
доводят рН до 4.8 +0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании
добавляя 20 % раствор уксусной кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
11.3.3. Приготовление 0.067 М фосфатного буферного раствора,рН 7.2
Взвешивают 7.67 г безводного гидрофосфата натрия, 2.02 г дигидрата
дигидрофосфата натрия и 8.7 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную
колбу
на 1000 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
Раствор тщательно перемешивают до растворения осадка и переливают в химический
стакан на 1000 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят
рН
до 7.2 ± 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя
раствор ортофосфорной кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
11.3.4. Приготовление 0.02 М фосфатного буферного раствора,
рН 7.2
Взвешивают 2.3 г безводного гидрофосфата натрия, 0.62 г
дигидрата дигидрофосфата натрия и 9.0 г хлорида натрия.
Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл и доводят объем
раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно
перемешивают до растворения осадка и переливают в химический стакан
на 1000 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости
доводят рН до 7.2 ± 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном
перемешивании добавляя раствор ортофосфорной кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
11.3.5. Приготовление 0.02 М буферного раствора
трис/метанол (20%), рН 8.5
Навеску 0.242 г трис-(гидроксиметил)-аминометана переносят в
мерную колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до
растворения осадка и с помощью рН-метра измеряют значение рН.
При необходимости доводят рН до 8.5 ± 0.1 осторожно, по каплям
и при постоянном перемешивании добавляя 1М раствор соляной
кислоты. Раствор с установленным значением рН переносят в колбу
на 250 мл и смешивают с 25 мл метанола.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
11.3.6. Приготовление 40% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 40 мл метанола и доводят
объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно
перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4
недели.
11.3.7. Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят
объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно
перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4
недели.
12. Пробоподготовка
12.1. Пробы мочи
12.1.1. Исследуемая проба мочи объемом 0.5 мл смешивается с
3 мл ацетатного буферного раствора концентрации 0.05 М (рН 4.8).
12.1.2. С помощью дозатора в смесь вносят 8 мкл
глюкоронидазы/арилсульфатазы и выдерживают раствор в термостате
при температуре 37°С в течение 3-х часов.
12.1.3. Очистка пробы методом твердофазной экстракции.
12.1.3.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции,
руководствуясь инструкцией по его эксплуатации, промойте колонку rida®
c18 2 мл
метанола со скоростью 1 капля в секунду.
При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для
создания давления воздуха на входе в колонку используйте разовый
пластиковый шприц на 5 мл.
12.1.3.2. Пропустите через колонку 2 мл ацетатного буферного
раствора концентрации 0.05 М (рН 4.8) со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.3. Пропустите через колонку 1 мл подготовленного
раствора исследуемой пробы со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.4. Промойте колонку 2 мл ацетатного буферного
раствора концентрации 0.05 М (рН 4.8) со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.5. Промойте колонку 2 мл 40% раствора метанола со
скоростью 1 капля в секунду. Удалите из колонки остатки жидкости.
12.1.3.6. Адсорбированные на колонке вещества осторожно, со
скоростью 15 капель в минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в
чистую пробирку, объемом 5 мл.
12.1.3.7. В пробирку с элюатом добавляют 1 мл дистиллированной воды.
Содержимое пробирки перемешивают.
12.1.3.8. Для анализа используют 50 мкл раствора.
Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться
течении 3- 4 месяцев при температуре - 20°С или 2 недели при температуре
2 - 8 °С.
12.2. Пробы мяса.
12.2.1. Исследуемые образцы мяса должны быть свободны от жира и соединительной
ткани.
12.2.2. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.
12.2.3. Навеску 10 г фарша и 10 мл 0.067 М фосфатного буферного раствора
(рН 7.2)
переносят в коническую колбу на 50 мл, закрывают колбу притертой пробкой
и энергично
встряхивают в течение 5-ти минут.
12.2.4. Навеску 2 г гомогената переносят в центрифужную пробирку на
10 - 15 мл,
снабженную завинчивающейся крышкой.
12.2.5. В центрифужную пробирку с гомогенатом вносят 5 мл метилтретбутилового
(диэтилового) эфира и энергично встряхивают содержимое в течении 20 мин
при помощи
устройства для встряхивания проб либо вручную.
12.2.6. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении
3000 д и
температуре 10 - 15°С в течение 10 мин.
12.2.7. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае недостаточно
эффективного
разделения процедуру центрифугирования повторяют.
12.2.8. С помощью пипетки Пастера и груши эфирный слой переносят в
пробирку
устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии такого устройства,
в
грушевидную колбу лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1). При
заборе
эфирного слоя в пипетку Пастера избегайте попадания в пипетку водной фазы.
12.2.9. Повторите процедуру экстракции согласно пп.12.2.5.- 12.2.8.
12.2.10. Объедините эфирные экстракты и испарите их досуха в вытяжном
шкафу.
Примечание: для испарения экстрактов можно использовать специализированное
устройство для испарения экстрактов, лабораторный микроиспаритель (см.
Приложение 1), либо
водяную баню и подходящий к имеющейся центрифуге стеклянный флакон на 20
- 30 мл с
завинчивающейся крышкой, материал которой устойчив к использующимся реагентам.
При
выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют
с помощью
термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира - 55.5°С, температура
кипения
диэтилового эфира - 34.5°С).
12.2.11. После испарения эфирного слоя досуха в пробирку (флакон,
колбу) с сухим
остатком поместите 1 мл 80% раствора метанола и тщательно омойте стенки
пробирки (флакона,
колбы).
12.2.12. Смешайте метанольный раствор и 2 мл 0.02 М фосфатного буферного
раствора.
Далее раствор очищается методом твердофазной экстракции.
12.2.13. Очистка методом твердофазной экстракции.
12.2.13.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции, руководствуясь
инструкцией по его эксплуатации, промойте колонку rida® c18 3 мл метанола
со скоростью 1 капля
в секунду. При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания
давления
воздуха на входе в колонку используйте разовый пластиковый шприц на 5 мл.
12.2.13.2. Пропустите через колонку 2 мл 0.02 М фосфатного буферного
раствора со
скоростью 1 капля в секунду.
12.2.13.3. Пропустите через колонку весь объем подготовленного раствора
исследуемой
пробы со скоростью 1 капля в секунду.
12.2.13.4. Промойте колонку 2 мл 40% раствора метанола со скоростью
1 капля в секунду.
12.2.13.5. Удалите из колонки остатки жидкости и высушите колонку,
продувая ее воздухом
или азотом в течение 3-х минут.
12.2.13.6. Адсорбированные на колонке вещества осторожно, со скоростью
15 капель в
минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую пробирку, объемом
5 мл.
12.2.13.7. В пробирку с элюатом добавляют 1 мл дистиллированной воды.
Содержимое
пробирки перемешивают.
12.2.13.8. Для анализа используют 20 мкл раствора.
Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться течении 3-4 месяцев
при
температуре - 20°С или 2 недели при температуре 2 - 8 °С.
Примечание: процедура пробоподготовки, описанная в разделе 12.2 методики
может
быть также использована и при определении тренболона,
19-
нортестостерона, этинилэстрадиола, тестостерона и эстрадиола-17р
в
пробах мяса с помощью тест-систем ridascreEn® trenbolon,
ridascreEn® 19-nortestosteron, ridascreEn® ethinylostradiol,
ridascreEn® testosteron и ridascreEn® 17p-6stradiol
13. Порядок проведения измерений
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью
тест-системы
ridascreEn® methyltestosteron.
Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов
до
комнатной (30 - 40 минут до температуры 18 - 20 °С)
Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры
2-
8°С
В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета
Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа существенно
зависит от
тщательности отмывки планшета в процессе анализа.
Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета
На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.
13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Приготовление препарата коньюгата
Коньюгат метилтестостерона с ферментом (флакон с красной крышкой)
поставляется в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат коньюгата имеет
ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество
препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата коньюгата осторожно
встряхните
содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию препарата
коньюгата разбавьте концентрированный препарат буферным раствором,
имеющимся в
комплекте набора, в отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл
смешайте
200 мкл концентрированного препарата коньюгата с 2 мл буфера - данного
разведения
достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)
13.2.2. Приготовление препарата антител
Антитела к метилтестостерону (флакон с черной крышкой) поставляются
в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат антител имеет
ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество
препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата антител осторожно встряхните
содержимое
флакона. Для приготовления готового к использованию препарата антител
разбавьте
концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в
комплекте набора, в отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл
смешайте 200 мкл
концентрированного препарата антител с 2 мл буфера - данного разведения
достаточно
для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)
3.2.3. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами.
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь menaundhlne количество
стрипов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет
вместе с
силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение
при температуре 2 -
8°С.
13.2.4. Стандартные растворы
Стандартные растворы метилтестостерона поставляются готовыми для использования
в
следующих концентрациях:
Стандарт 1 0 ppt
Стандарт 2 50 ppt
Стандарт 3 150 ppt
Стандарт 4 450 ppt
Стандарт 5 1350 ppt
Стандарт 6 4050 ppt
Примечание: 1 ppt = 1 нг/кг
13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве,необходимом
для выполнения всех
запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты
лунок, предназначенных
для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов.
Пример формы записи приведен на Рис. 1.
С1 С1 ПЗ ПЗ П11 П11 П19 П19 П27 П27 П35 П35
С2 С2 П4 П4 П12 П12 П20 П20 П28 П28 П36 П36
СЗ СЗ П5 П5 П13 П13 П21 П21 П29 П29 П37 П37
С4 С4 П6 П6 П14 П14 П22 П22 ПЗО ПЗО ПЗЗ П38
С5 С5 П7 П7 П15 П15 П23 П23 П31 П31 П39 П39
С6 Сб П8 П8 П16 П16 П24 П24 П32 П32 П49 П49
П1 П1 П9 П9 П17 П17 П25 П25 ПЗЗ ПЗЗ П41 П41
П2 П2 П10 П10 П18 П18 П26 П26 П34 П34 П42 П42
Рисунок 1. Пример формы записи координат лунок перед
выполнением анализа (С-стандарты, П-пробы).
13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл разбавленного препарата
коньюгата в
каждую лунку и по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие
пары лунок.
При дозировании раствора коньюгата и выполнении последующих операций предпочтительно
использование 8-ми канального дозатора (при этом раствор удобно отбирать
из специальной
ванночки или из чашки Петри).
13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного препарата
антител.
Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в
лунках и оставьте
планшет на инкубацию в темноте в течение одной ночи (12-16 часов) при температуре
2 - 8 °С.
13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно
выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания
рамки с лунками по
столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250 мкл дистиллированной
воды и
вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше. Повторите процедуру
промывки лунок
водой еще два раза.
13.3.5. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую
лунку. Тщательно
перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут
в темноте.
13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо
перемешайте. В
течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую
плотность в каждой
лунке при 450 нм.
14. Обработка результатов исследования
14.1. Вычисление концентрации метилтестостерона в исследуемых образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными
и
исследуемыми растворами, делятся на среднее значение оптической плотности,
измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100.
Таким образом, результат
измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической
плотности лунки с
нулевым стандартом, то есть:
Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
———-—————————————————————— x 100 = % поглощения
Средняя оптическая
плотность лунки
с нулевым стандартом
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных
растворов и
соответствующим значениям концентрации метилтестостерона в нг/кг (ppt)
строится калибровочная
кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна
быть почти
линейна в диапазоне 150 - 4050 нг/кг (см. Рис. 2).
Концентрация метилтестостерона в исследуемых растворах в нг/кг
(ppt) считывается по
калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному
и вычисленному
для этих растворов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать
специализированное программное обеспечение, например, rida®soft .
При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией
по
использованию программного обеспечения.
Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию метилтестостерона
в
исследуемой исходной пробе, величину концентрации метилтестостерона,
полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий
фактор
разбавления. При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии
с
приведенной методикой
фактор разбавления принимает следующие значения:
Моча 4
Мясо 2
Концентрация, нг/кг
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы
ridascreEn® methyltestosteron
ПРИМЕЧАНИЕ: При положительном результате определения исследование
образцов,
показавших положительный результат, повторяют. При повторном
исследовании
образцов рекомендуется выполнить оценку коэффициента извлечения
с
помощью внесения в образец добавки метилтестостерона на стадии
пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см.
Приложение 2).
15. Интерпретация результатов исследования
Использование метилтестостерона в животноводстве и птицеводстве,
импорт и
реализация продукции животного происхождения, содержащей остаточные
количества
метилтестостерона, запрещены как в странах Евросоюза так и в Российской
Федерации.
Чувствительность иммуно-ферментного метода анализа позволяет
определять
концентрации метилтестостерона в мясе на уровне 0.1 мкг/кг и более.
Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля при положительном
результате определения проводят подтверждающий анализ независимым методом
(используется,
например, хроматомасс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная
хроматография),
обладающим худшей чувствительностью, результат определения интнрпретируют
как
положительный если величина найденной концентрации больше предела обнаружения
независимого метода анализа.
Предел обнаружения хромато-масс-спектрометрического метода
определения
метилтестостерона составляет 2 мкг/кг.
Пробы с найденной концентрацией метилтестостерона в диапазоне от 0.1
мкг/кг до 2 мкг/кг
рассматривают как “подозрительные”.
.gif){kind=small}
.gif){kind=small}