МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Утверждаю
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
Заместитель Руководителя
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)
В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
№ 13-7-2/1868 от 10.02.2000
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ
ОПРЕДЕЛЕНИЮ КЛЕНБУТЕРОЛА
В ОБРАЗЦАХ МЯСА, ПЕЧЕНИ, ГЛАЗНОГО
ЯБЛОКА И МОЧИ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-
СИСТЕМЫ РИДАСКРИН КЛЕНБУТЕРОЛ
(ridascreEn® clenbuterol fast)
(производство
фирмы Ар-Биофарм/r-biopharm, Германия)
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения
кленбутерола и других бетта-
агонистов в мясе, печени, моче и глазном яблоке с помощью
тест-системы для иммунно-
ферментного анализа ridascreEn® clenbuterol fast*.
*ridascreEn® и rida® являются зарегистрированными товарными
знаками фирмы r-biopharm,
Германия
2. Краткое описание методики
Пробоподготовка:
Моча - без пробоподготовки
Мясо, печень - очистка методом твердофазной экстракции
Глазное яблоко - замораживание/вытаивание
Затраты времени:
Пробоподготовка (при обработке
10-ти проб)
Моча
10 минут
Мясо и печень
около 6 часов
Глазное яблоко
около 30-ти минут
Анализ (независимо от количества около 45
минут
проб)
Предел обнаружения
0.04 мкг/кг (40 ppt)
для образцов мяса:
0.04 мкг/кг (40 ppt)
для образцов печени:
0.1 мкг/кг (100 ppt)
для образцов глазного яблока: 0.2 мкг/кг (200 ppt)
Сходимость результата
анализа
коэффициент вариации
не хуже 10%
Извлекаемость (для образцов мочи): 90%
Перекрестная чувствительность:
кленбутерол
100.0%
бромбутерол
150.0%
тербуталин
10.0%
caльбутамол
10.0%
циматерол
6.0 %
мабутерол
86.0 %
карбутерол
4.0%
изопротеренол
<0.1%
адреналин
< 0.01 %
норадреналин
< 0.01 %
3. Общие положения
Кленбутерол принадлежит к группе веществ, называемых
бетта-агонистами. Известно, что бетта-
агонисты стимулируют рост мышечной массы и регулируют
соотношение жировой и мышечной
ткани при выращивании сельскохозяйственных животных и
птицы.
Было, однако, показано, кленбутерол и другие бетта-агонисты
при их потреблении с пищей
могут спровоцировать тахикардию и резкий подъем кровяного
давления. При хроническом
поступлении кленбутерола и других бетта-агонистов в организм
человека могут наблюдаться
нарушения обмена веществ.
Использование кленбутерола и других бетта-агонистов в
животноводстве и птицеводстве,
импорт и реализация продуктов животного происхождения,
содержащих остаточные концентрации
кленбутерола и других бетта-агонистов, запрещены в Российской
Федерации и в странах Европейского
союза (Указание Главного государственного ветеринарного
инспектора от 4.10.99 № 12-7-1/900,
Правила по организации государственного
ветеринарного надзора за содержанием гормональных
стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного
происхождения, утвержденные
приказом МИНСЕЛЬХОЗПРОДА России от 18.08.99 № 604, Директивы
Евросоюза 89/662/ЕЕС,
90/425/ЕЕС, 96/22/ЕС, 96/23/ЕС и др).
Для определения ?-агонистов используются инструментальные
физико-химические методы
анализа, такие как жидкостная хроматография высокого
давления (ВЭЖХ) и хромато-масс-
спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, предусматривают
использование дорогостоящего
оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном
обслуживании.
В последнее время в рутинной лабораторной практике широко
применяется более удобный
иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, elisa), являющийся
официальным методом контроля
продуктов животного происхождения, принятым в странах
Евросоюза (Директива 93/257/ЕЕС).
4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация
и общие правила
безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая
искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования
и номенклатура средств
защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная.
Цилиндры, мензурки, колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические
методы определения
свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые.
Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические
методы
определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и
образцовые. Общие
технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные.
Типы, основные
параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки
с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные.
Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки
градуированные. Общие
требования.
5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов
с антителами.
Планшет, входящий в состав набора ridascreEn® clenbuterol
fast, сенсибилизирован
овечьими антителами, специфичными к кроличьему иммуноглобулину
igg, который, в свою
очередь, получен путем иммунизации кроликов кленбутеролом.
Анализ выполняется следующим
образом.
В лунки планшета дозируется раствор, содержащий антитела
к кленбутеролу (кроличий
igg). При инкубации планшета в течение определенного
времени происходит иммуносорбция
антител к кленбутеролу овечьими антителами на поверхности
планшета.
После промывки планшета дистиллированной водой в лунки
планшета дозируются
исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий
коньюгат кленбутерола с
ферментом. Во время последующей инкубации планшета происходит
конкурентная иммуносорбция
молекул кленбутерола и молекул коньюгата кленбутерола
антителами, связанными на поверхности
планшета на предыдущей стадии инкубации. Молекулы коньюгата
кленбутерола с ферментом, не
адсорбировавшиеся на поверхности во время инкубации,
удаляются при промывке планшета.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор
субстрата (пероксид карбамида)
и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе
инкубации, при химическом
взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный
фрагмент молекулы коньюгата,
связанной на поверхности лунки, выступает в качестве
катализатора, образуются окрашенные
продукты реакции. Через определенное время развития цветной
реакции, в результате которой
бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки
добавляется стоп-реагент, при этом
голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре
(ридере) при 450 нм,
обратно пропорциональна концентрации диэтилстильбестрола
в исследуемых образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1. Предел обнаружения кленбутерола составляет:
• 0.04 мкг/кг в мясе при навеске образца 5 г
• 0.04 мкг/кг в печени при навеске образца 5 г
• 0.1 мкг/л в моче при объеме образца 20 мкл
• 0.2 мкг/л в глазном яблоке при объеме образца
0.5 мл
6.2. Диапазон определяемых концентраций кленбутерола составляет:
• 0.04 - 3.24 мкг/кг в мясе при навеске образца
5 г
• 0.04 - 3.24 мкг/кг в печени при навеске образца
5 г
• 0.1-8.1 мкг/л в моче при объеме образца 20 мкл
• 0.2 - 16.2 мкг/л в глазном яблоке при объеме
образца 0.5 мл
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы
и материалы
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности
с наибольшим пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
рН-метр
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Дозаторы на 20, 50, 100, 250 и 1000 мкл
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 100 и
500 мл исполнения 2 по ГОСТ
1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50
и 100 мл по ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью
1, 5 и 10 мл по ГОСТ 29227
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1°С,
пределы измерения 0-100°С по
ГОСТ 29224.
7.2. Вспомогательные устройства
Мясорубка по ГОСТ 4025
Микроизмельчитель тканей (гомогенизатор) РТ-2 или “Ультратюракс”
с частотой 8000 -
24000 об/мин
Центрифуга с устанавливаемым ускорением 4000 g и охлаждением
Центрифужная пробирка емкостью 50 - 60 мл с завинчивающейся
крышкой
Центрифужная пробирка на 10 мл
Устройство для испарения экстрактов, например, системы
tcs, “Эвапорэк” и др. или баня
водяная или суховоздушная
Устройство для перемешивания типа “вортекс”
Устройство для встряхивания проб
Устройство для твердофазной экстракции, например типа
“Доркус”, “Вакэлют” и др. или
разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пипетки Пастера
Пробирки П-2-5-14/23 и П-2-10-14/23 с притертыми стеклянными
пробками
Мембранный насос (возможно использование обычного аквариумного
насоса)
Трубка стеклянная соединительная (тройник) типа ТС-Т
Шланг резиновый соединительный
Зажим Гофмана на резиновый шланг
Колба коническая со шлифом и притертой пробкой типа КН-1-100-19/26
по ТУ 92-891.029-91
Стаканы химические вместимостью 50, 100, 250 и 1000 мл
по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Штатив лабораторный
Груша резиновая
Холодильник бытовой
7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа ridascreEn®clenbuterol
fast* в
стандартной комплектации,
включая:
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по
8 лунок),
сенсибилизированный антителами к кроличьему igg
1 шт
Комплект стандартных растворов кленбутерола в воде
со следующими концентрациями (1 рр1=1нг/кг):
О ppt (нулевой стандарт), 100 ppt, 300 ppt, 900 ppt,
2700 ppt,
8100 ppt, по 300 мкл
6х1шт
Коньюгат кленбутерола с пероксидазой,
конц. (красная крышка)
1 шт
Антитела к кленбутеролу,
конц. (черная крышка)
1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида,
7 мл (зеленая крышка)
1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензидин,
7 мл (голубая крышка)
1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты,
14 мл (желтая крышка)
1 шт
Буфер, для разбавления конц. растворов
коньюгата и антител, 25 мл
1 шт
Колонки для твердофазной экстракции марки rida® c18*
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
н-Гептан, c7h16
Метанол, СНзОН
Ортофосфорная кислота, НзРОз, концентрированная
Соляная кислота, НСl, конц. 20%
Гидрооксид натрия, naoh
Трис-(гидроксиметил)-аминометан (трис), (ch2oh)3cnh2
Дигидрофосфат калия, безводный, КН2Р04
Замечания по использованию и хранению тест-системы ridascreEn®
clenbuterol
fast
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере
чувствительности
определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами
из другого набора с
другим номером партии.
Храните набор при температуре 2 - 8 °С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ
НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте
их в фольгированный пакет
вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.
Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны,
избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы
с растворами.
Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора
хромогена не
рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание
раствора хромогена
является признаком его порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной
в лунке с нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком
порчи реагентов.
8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования
техники безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007,
требования пожарной безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019, а также
требования, указанные в технической документации на весы,
спектрофотометр и вспомогательные
устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений,
должно быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими
растворителями необходимо проводить
в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.
9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
специалиста, имеющего
высшее или среднее специальное химическое образование
или опыт работы в химической
лаборатории, владеющего техникой иммунно-ферментного
анализа и освоившего метод в
процессе стажировки.
10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены
следующие
условия:
Температура воздуха
20 ± 5 °С;
Атмосферное давление
84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздухане более
80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети
220 ± 10 В;
Частота переменного тока
50 ± 1 Гц
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269, ГОСТ 7702.0
и согласно действующей
нормативной документации.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.
11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в
лабораторию. При отсутствии
такой возможности допускается хранение образцов не более
чем 2 суток с момента отбора при
температуре 2 - 8°С, либо 5-6 месяцев при температуре
- 20°С.
11.3. Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление раствора фосфорной кислоты концентрации
1М.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 9.8г концентрированной
ортофосфорной
кислоты. С помощью стеклянной воронки кислоту переносят
в мерную колбу на 100 мл. Стакан
омывают двумя порциями дистиллированной воды по 10 мл.
Смывы последовательно переносят в
мерную колбу с кислотой и разбавляют раствор дистиллированной
водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4
недели.
11.3.2. Приготовление 1М раствора гидрооксида натрия.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 4.0 г гидрооксида
натрия. В стакан наливают
50 мл дистиллированной воды и перемешивают раствор до
полного растворения щелочи. С
помощью стеклянной воронки раствор переносят в мерную
колбу на 100 мл. Стакан омывают двумя
порциями дистиллированной воды по 10 мл. Смывы последовательно
переносят в мерную колбу с
раствором и разбавляют раствор дистиллированной водой
до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4
недели.
11.3.3. Приготовление 0.5 М раствора дигидрофосфата калия,
рН 3.
Взвешивают 6.8 г безводного дигидрофосфата калия. Навеску
переносят в мерную колбу
на 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной
водой. Раствор тщательно
перемешивают до растворения осадка и переливают в химический
стакан на 250 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости
доводят рН до 3.0 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя
1М раствор ортофосфорной
кислоты.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.
11.3.4. Приготовление 0.05 М раствора дигидрофосфата калия,
рН 3.
С помощью пипетки переносят 10 мл 0.5 М раствора дигидрофосфата
калия в мерную
колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной
водой. Раствор тщательно
перемешивают и переливают в химический стакан на 250
мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости
доводят рН до 3.0 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя
1М раствор ортофосфорной
кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
11.3.5. Приготовление 0.05 М раствора соляной кислоты.
С помощью пипетки переносят 0.8 мл концентрированной
20 % соляной кислоты в мерную
колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной
водой. Раствор тщательно
перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.
11.3.6. Приготовление буферного раствора трис, рН 8.5
Навеску 3.025 г трис-(гидроксиметил)-аминометана переносят
в мерную колбу на 500 мл и
доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
Раствор тщательно перемешивают до
растворения осадка и с помощью рН-метра измеряют значение
рН. При необходимости доводят рН
до 8.5 ± 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании
добавляя раствор соляной
кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
12. Пробоподготовка
12.1. Пробы мочи
При исследовании прозрачных проб мочи пробоподготовки
не требуется.
В случае исследования мутных проб мочи рекомендуется
отцентрифугировать или
отфильтровать пробы перед анализом.
12.2. Пробы печени и нежирного мяса.
12.2.1. Исследуемые образцы должны быть свободны от жира
и соединительной ткани.
12.2.2. Пробу измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.
12.2.3. Навеску 5 г фарша переносят в центрифужную пробирку
на 50 мл и гомогенизируют
с 25 мл 0.05 М раствора соляной кислоты с помощью гомогенизатора
в течение одной минуты.
Пробирку закрывают герметичной крышкой и встряхивают
в течение 1.5 часов.
Кислые гомогенаты могут храниться при температуре 2 -
8 °С до 3-х дней.
12.2.4. Навеску 6 г гомогената переносят в центрифужную
пробирку на 10 мл и
центрифугируют при ускорении 4000 g и температуре 10
- 15 °С в течение 15 минут.
12.2.5. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае
недостаточно эффективного
разделения процедуру центрифугирования повторяют.
12.2.6. С помощью пипетки Пастера и груши перенесите верхний
слой в другую
центрифужную пробирку на 10 мл, с помощью градуированной
пипетки на 1 мл добавьте в пробирку
300 мкл 1 М раствора гидрооксида натрия, закройте крышку
пробирки и перемешивайте раствор в
течение 15 минут.
12.2.7. С помощью градуированной пипетки на 5 мл перенесите
в пробирку 4 мл 0.5 М
раствора дигидрофосфата калия (рН 3) и перемешайте содержимое
пробирки. Оставьте пробирку в
холодильнике при температуре 4 °С на ночь или по крайней
мере на 1.5 часа.
12.2.8. Центрифугируйте при ускорении 4000 g и температуре 10 - 15 °С в течение 15 минут.
12.2.9. Прозрачный отцентрифугированный раствор доводится
до комнатной температуры и
очищается методом твердофазной экстракции.
Раствор стабилен в течение 2-х дней при температуре 2
- 8°С. В случае хранения раствора
отцентрифугируйте его повторно перед очисткой.
12.2.10. Очистка пробы методом твердофазной экстракции.
Внимание:Температуру реагентов и очищаемых растворов
необходимо довести до
комнатной!
12.2.10.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции,
руководствуясь
инструкцией по его эксплуатации, промойте колонку rida®
c18 3 мл метанола со скоростью 1
капля в секунду. При отсутствии устройства для твердофазной
экстракции для создания давления
воздуха на входе в колонку используйте разовый пластиковый
шприц на 5 мл.
12.2.10.2. Пропустите через колонку 2 мл 0.05 М раствора
дигидрофосфата калия (рН 3) со
скоростью 1 капля в секунду.
12.2.10.3. Пропустите через колонку весь объем подготовленного
раствора исследуемой
пробы со скоростью 1 капля в секунду.
12.2.10.4. Промойте колонку 2 мл 0.05 М раствора дигидрофосфата
калия (рН 3) со
скоростью 1 капля в секунду.
12.2.10.5. После удаления из колонки остатков жидкости,
колонка высушивается в токе
воздуха или азота в течение двух минут.
12.2.10.6. Адсорбированные на сухой колонке вещества осторожно,
со скоростью 15 капель
в минуту, элюируют 1 мл метанола в чистую пробирку, объемом
5 мл.
Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться
в течение 3- 4 недель при
температуре - 20°С или в течение 2 недель при температуре
2 - 8 °С.
12.2.10.7 Пробирку с элюатом помещают в водяную баню,
находящуюся при температуре
50 - 60°С. Температуру бани контролируют с помощью термометра.
Раствор испаряют досуха в
слабом токе воздуха, подающегося в пробирку мембранным
насосом через пипетку Пастера, при
этом кончик пипетки Пастера должен находиться на расстоянии
2 - 3 см от поверхности
метанольного раствора. Поток воздуха регулируют с помощью
зажима Гофмана, стравливая
избыточное давление через тройник в атмосферу.
12.2.10.8. Сухой остаток в пробирке растворяют в 0.4 мл
дистиллированной воды. Для
анализа используют 20 мкл раствора.
Раствор в дистиллированной воде может храниться в течение
одной недели при
температуре 2 - 8 °С.
При необходимости измерения высоких концентраций кленбутерола
в образцах
печени и мяса (более 3.0 мкг/кг) растворы разбавляют
дистиллированной водой.
12.3. Пробы мяса.
12.3.1. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки либо
другим способом.
12.3.2. Навеску 5 г фарша и 25 мл буферного раствора
трис (рН 8.5) переносят в
коническую колбу на 100 мл, закрывают колбу притертой
пробкой и энергично встряхивают в
течение получаса.
12.3.3. С помощью мерного цилиндра переносят 15 мл н-гептана
в колбу и энергично
встряхивают колбу в течении 5 минут для обезжиривания
гомогената.
12.3.4. Переносят содержимое колбы в центрифужную пробирку
на 50 - 60 мл и
центрифугируют в течение 5 мин при температуре 10 - 15
°С и ускорении 4000 g.
12.3.5. С помощью пипетки Пастера отбирают из пробирки
гептановый слой вместе с
тонким слоем жира на границе разделения фаз и отбрасывают
его.
12.3.6. Гомогенат переносят в ту же коническую колбу и
повторяют процедуру
обезжиривания согласно пунктам 12.3.3. - 12.3.5 (для
центрифугирования используют ту же
пробирку).
12.3.7. В пробирку с обезжиренным гомогенатом с помощью
пипетки добавляют 0.5 мл
концентрированной (20%) соляной кислоты, закрывают пробирку
крышкой и энергично встряхивают
в течение одного часа.
12.3.8. Навеску 6 г закисленного гомогената переносят
в центрифужную пробирку на 10 мл
и далее следуют процедуре пробоподготовки, начиная с
раздела 12.2.4.
12.4. Пробы глазного яблока.
12.4.1. Для разрушения клеток заморозьте образец глазного
яблока при температуре - 20 °С.
12.4.2. Разморозьте образец и разрежьте его острым скальпелем
с двух сторон.
12.4.3. Соберите 0.5 мл талой жидкости в пробирку и добавьте
равный объем
дистиллированной воды.
12.4.4. Для анализа используют 20 мкл раствора.
В случае если необходимо сохранить пробу, талую жидкость
следует заморозить заново и
исследовать не позже чем через 4 недели.
13. Порядок проведения измерений
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений
с помощью тест-системы
ridascreEn® clenbuterol fast
-Перед использованием тест-системы доведите температуру
всех реагентов до
комнатной (30-40 минут до температуры 18-20 °С).
-Немедленно после использования охладите все оставшиеся
реагенты до температуры
2 - 8°С.
-В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания
лунок планшета.
-Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа
существенно зависит
от тщательности отмывки планшета в процессе анализа.
Внимательно следуйте описанной
далее процедуре отмывки планшета.
-На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого
солнечного света.
13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Приготовление препарата коньюгата
Коньюгат кленбутерола с ферментом (флакон с красной крышкой)
поставляется в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат
коньюгата имеет ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только
необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата коньюгата
осторожно встряхните содержимое
флакона. Для приготовления готового к использованию препарата
коньюгата разбавьте
концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся
в комплекте набора, в отношении
1:11 (например, в пробирке на 10 мл смешайте 400 мкл
концентрированного препарата коньюгата с
4 мл буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов,
то есть для 32 определений)
13.2.2. Приготовление препарата антител
Антитела к кленбутеролу (флакон с черной крышкой) поставляются
в концентрированном
виде. Поскольку разбавленный препарат антител имеет ограниченную
стабильность, перед
анализом следует готовить только необходимое количество
препарата. Перед разбавлением
концентрированного препарата антител осторожно встряхните
содержимое флакона. Для
приготовления готового к использованию препарата антител
разбавьте концентрированный
препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора,
в отношении 1:11 (например, в
пробирке на 10 мл смешайте 400 мкл концентрированного
препарата антител с 4 мл буфера -
данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть
для 32 определений)
13.2.3.Микротитровальный планшет, сенсибилизированный
антителами
Перед
выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое
количество
стрипов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный
пакет с силикагелем
(осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на
хранение при температуре 2 - 8 °С.
13.2.4. Стандартные растворы
Стандартные растворы кленбутерола поставляются готовыми
для использования в
следующих концентрациях:
Стандарт 1
o ppt
Стандарт 2
100 ppt
Стандарт 3
300 ppt
Стандарт 4
900 ppt
Стандарт 5
2700 ppt
Стандарт 6
8100 ppt
Примечание: 1 ppt = 1 нг/кг
13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве,
необходимом для выполнения всех
запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите
координаты лунок, предназначенных
для стандартных растворов и подготовленных исследуемых
растворов. Пример формы записи
приведен на Рис.1.
| c1 | С1 | ПЗ | ПЗ | П11 | П11 | П19 | П19 | П27 | П27 | П35 | П35 |
| С2 | С2 | П4 | П4 | П12 | П12 | П20 | П20 | П28 | П28 | П36 | П36 |
| СЗ | СЗ | П5 | П5 | П13 | П13 | П21 | П21 | П29 | П29 | П37 | П37 |
| С4 | С4 | П6 | П6 | П14 | П14 | П22 | П22 | ПЗО | ПЗО | П38 | П38 |
| С5 | С5 | П7 | П7 | П15 | П15 | П23 | П23 | П31 | П31 | П39 | П39 |
| С6 | С6 | П8 | П8 | П16 | П16 | П24 | П24 | П32 | П32 | П49 | П49 |
| П1 | П1 | П9 | П9 | П17 | П17 | П25 | П25 | ПЗЗ | ПЗЗ | П41 | П41 |
| П2 | П2 | П10 | П10 | П18 | П18 | П26 | П26 | П34 | П34 | П42 | П42 |
Рисунок 1. Пример формы
записи координат лунок перед выполнением
анализа (С-стандарты, П-пробы).
13.3.2. С помощью дозатора внесите в каждую лунки по 100
мкл готового разбавленного
препарата антител (предпочтительно использование 8-ми
канального дозатора, при этом раствор
удобно отбирать из специальной ванночки или из чашки
Петри). Оставьте планшет на инкубацию в
течение 15-ти минут при комнатной температуре.
13.3.3. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета
и тщательно выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного
постукивания рамки с лунками по
столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки
250 мкл дистиллированной воды и
вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше.
Повторите процедуру промывки лунок
водой еще два раза.
13.3.4. С помощью одноканального дозатора добавьте по
20 мкл стандартных и
исследуемых растворов в соответствующие пары лунок.
13.3.5. Добавьте по 100 мкл разбавленного препарата коньюгата
в каждую лунку. Оставьте
планшет на инкубацию в течение 30-ти минут при комнатной
температуре.
13.3.6. Промойте лунки планшета, как описано в п. 13.3.3.
13.3.7. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена
в каждую лунку. Тщательно
перемешайте (можно осторожно постучать по периметру рамки
рукой) и инкубируйте при
комнатной температуре в течение 15 минут в темноте.
13.3.8. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента
и хорошо перемешайте. В
течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте
оптическую плотность в каждой
лунке при 450 нм.
14. Обработка результатов исследований
14.1. Вычисление концентрации кленбутерола в исследуемых
образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках
со стандартными и
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической
плотности, измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается
на 100. Таким образом, результат
измерения оптической плотности выражается в процентах
от оптической плотности лунки с
нулевым стандартом, то есть:
Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
———————————————————————————— x 100 = % поглощения
Средняя оптическая плотность лунки
с нулевым стандартом
По величинам относительного поглощения, вычисленным для
стандартных растворов и
соответствующим значениям концентрации кленбутерола в
нг/кг (ppt) строится калибровочная
кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная
кривая должна быть почти
линейна в диапазоне 200 - 2000 нг/кг (см. Рис. 2).
Концентрация кленбутерола в исследуемых растворах в нг/кг
(ppt) считывается по
калибровочной кривой соответственно относительному поглощению,
измеренному и вычисленному
для этих растворов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется
использовать
специализированное программное обеспечение, например,
rida®soft. При компьютерной
обработке результатов следует руководствоваться инструкцией
по использованию программного
обеспечения.
Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию кленбутерола
в исследуемой
исходной пробе, величину концентрации кленбутерола, полученную
по калибровочной кривой,
следует умножить на соответствующий фактор разбавления.
При выполнении
пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной
методикой фактор
разбавления принимает следующие значения:
Мясо и печень
0.4
Моча
1
Глазное яблоко
2
Оптическая плотность,
(%)
Концентрация, нг/кг
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы
ridascreEn® clenbuterol fast
ПРИМЕЧАНИЕ: При положительном
результате определения исследование образцов,
показавших положительный результат, повторяют. При повторном
исследовании образцов рекомендуется выполнить оценку
коэффициента
извлечения с помощью внесения в образец добавки кленбутерола
на стадии
пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см.
Приложение 1).
15. Интерпретация результатов исследования
Использование кленбутерола и других бетта-агонистов в
животноводстве и птицеводстве,
импорт и реализация продукции животного происхождения,
содержащей остаточные количества
кленбутерола, полностью запрещены как в странах Евросоюза
так и в Российской Федерации.
Чувствительность иммуно-ферментного метода
анализа позволяет определять
концентрации кленбутерола в мясе и печени на уровне 0.04
мкг/кг и более.
Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля
при положительном
результате определения проводят подтверждающий анализ
независимым методом (используется,
например, хроматомасс-спектрометрия, высокоэффективная
жидкостная хроматография),
обладающим худшей чувствительностью, результат
определения интерпретируют как
положительный если величина найденной концентрации больше
предела обнаружения
независимого метода анализа.
Предел обнаружения хромато-масс-спектрометрического
метода определения
кленбутерола составляет 0.5 мкг/кг.
Пробы с найденной концентрацией кленбутерола, не превышающей
0.5 мкг/кг,
рассматривают как “подозрительные”.
.gif){kind=small}
.gif){kind=small}