МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ 
                 ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 
                ХЛАМИДИЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ЖИВОТНЫХ


1. Общие положения

2. Серологические исследования

3. Постановка ИФА

4. Обнаружение, выделение и идентификация хламидий и антигенов хламидий 

5. Выделение хламидий

6. Выявление ДНК хламидий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

7. Диагноз на хламидийные инфекции считают предварительным

8. Сроки исследований

    МИНИСТЕРСТВО 
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И 
    ПРОДОВОЛЬСТВИЯ 
 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России) 
                                                УТВЕРЖДАЮ
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                  Заместитель руководителя
                                         Департамента ветеринарии
30.06.99г.  № 13-7-2/643                     В.В.Селиверстов

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по лабораторной диагностике хла-
мидийных инфекций у животных

1. Общие положения.

1.1. Лабораторные методы исследования на хламидийные инфекции животных 
включают:

- выявление специфических антител в сыворотке крови больных животных в 
РСК (РДСК) или ИФА;

- обнаружение хламидий и их антигенов в патологическом материале 
методом световой или люминесцентной микроскопии;

- выделение хламидий на куриных эмбрионах, в культуре клеток или 
лабораторных животных с последующей их идентификацией;

- выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом полиме-
разной цепной реакции (ПЦР).

1.2. В лабораторию для исследования на хламидийные инфекции направля- 
ют:

- сыворотку крови в количестве 3-5 куб.см от абортировавших или подозри- 
тельных по заболеванию животных, а также во всех случаях, предусмотренных 
действующей инструкцией. Кровь от абортировавших животных берут дважды: в 
период клинического проявления болезни и повторно, от них же, через 14-21   
день. Сыворотки направляют в лабораторию в количестве 1-2 куб.см. Сыворотки 
хранят при температуре минус 20 °С и исследуют одномоментно. Сыворотки 
гемолизированные или контаминированные бактериальной и грибковой флорой не 
пригодны;

- патологический материал (соскобы с коньюнктивы, гениталий, фекалии) 
берут только одноразовыми или стерильными инструментами в одноразовые 
пластиковые пробирки с крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с 
резиновыми пробками с физраствором в количестве 1 куб.см и доставляют в 
лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал можно 
не более 7 суток при 4 °С и 10-12 мес. при температуре минус 20 °С;

- пробы эякулята или замороженной спермы, полученные от производите- 
лей, подозрительных по заболеванию. Пробы эякулята направляют для исследо- 
вания в количестве 1 куб.см; замороженную сперму в количестве не менее 2 
гранул доставляют в лабораторию в контейнере с жидким азотом или в 
пробирке с сухим льдом;

- патологический материал от павших или убитых больных животных (кусочки 
паренхиматозных органов, лимфатических узлов и семенников), от 
абортировавших животных (кусочки плаценты);

- абортированные плоды целиком или паренхиматозные органы и сычуг пло- 
да.

Патологический материал отбирают в стерильные, герметически закры- 
вающиеся флаконы не позднее двух часов после гибели, убоя животного или 
аборта.


Флаконы с патматериалом помещают в термос со льдом, а абортированные 
плоды во влагонепроницаемую тару и в тот же день, но не позже 24 часов, 
доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих распространение 
возбудителя инфекции.

2. Серологические исследования

2.1. Серологические исследования на хламидийные инфекции основаны на 
выявлении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции 
связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента 
(РДСК) и методом иммуноферментного анализа (ИФА); у абортировавших 
животных - на установлении нарастания титра антител в 4 и более раз.

Животных, вакцинированных против хламидийного аборта, серологически 
не исследуют в течение 1 года после вакцинации.

2.2. В РСК, РДСК используют следующие компоненты:

- комплементсвязывающий группоспецифический хламидийный антиген;
- контрольный антиген;
- позитивную (иммунную) сыворотку крови овец, содержащую группо-специ-
фические хламидийные антитела;
- негативную (отрицательную) сыворотку крови овец;
- комплемент (свежая, консервированная или лиофильно высушенная сы- 
воротка крови морской свинки);
- гемолизин (сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами 
барана);
- эритроциты барана;
- испытуемые сыворотки;
- физиологический раствор, рН 7,0-7,2.

Специфический и контрольный антигены, позитивную и негативную сыво- 
ротки изготавливают биофабрики, выпускающие их в специальных наборах.

Антиген разводят в дистиллированной воде и применяют в РСК, РДСК в 
рабочих титрах, указанных на этикетке.

2.3. Гемолизин в РСК и РДСК используют в удвоенном титре (например, при 
титре гемолизина 1:1000 его берут 2:1000).

2.4. Эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем цен- 
трифугирования при 2500-3000 об/мин. в течение 10-15 мин. до полной 
прозрачности над осад очной жидкости.

Для РСК применяют 2,5%-ную, для РДСК - 3%-ную взвесь эритроцитов из 
осадка.

Перед работой взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку в рабочем 
разведении смешивают в равных объемах, полученную гемолитическую систему 
ставят в термостат при 37°С на 20-30 мин. для сенсибилизации. Во время 
работы гемолитическую систему хранят при комнатной температуре или в 
холодильнике при 2-4 °С.

2.5. Для серологического исследования пригодны лишь свежие испытуемые 
сыворотки. Допускаются к исследованию и однократно замороженные, а также 
сыворотки, консервированные борной кислотой (2% к объему) или мертиолятом 
(1:10000).

Мутные, проросшие или гемолизированные сыворотки для исследования не- 
пригодны.

2.6. Физиологический раствор для разведения компонентов (0,85% раствор 
химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде, рН 7,2-7,4) 
готовят и кипятят в течение 5 минут за день или в день постановки реакции.

2.7. Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

2.7.1. Реакцию ставят в объеме 1 куб.см (по 0,2 куб.см каждого компонента). 
Комплемент титруют каждый раз перед постановкой главного опыта на позитивной 
и 1-2 испытуемых сыворотках.

2.7.2. Титрование комплемента. Сухой биофабричный комплемент раство- 
ряют физиологическим раствором до первоначального объема, указанного на 
этикетке, и готовят основное разведение 1:20.

Каждую сыворотку, разведенную 1:5 (1 куб.см сыворотки + 4 куб.см 
физиологического раствора) инактивируют при 58-60°С 30 мин, разливают по 
0,2 куб.см в два ряда пробирок штатива Флоринского. Титрование комплемента 
начинают с дозы 0,02 куб.см до 0,2 куб.см с интервалом по 0,02 куб.см. Для 
этого в дополнительный ряд пробирок вносят разведенный 1:20 комплемент в 
десятикратном объеме в дозах 0,2; 0,4;0,6; и т.д. до 2,0 куб.см и 
добавляют в каждую пробирку недостающее до 2 куб.см количество 
физиологического раствора, т.е. 1,8; 1,6; 1,4; и т.д. Затем из первого 
разведения комплемента переносят по 0,2 куб.см в первые пробирки всех 
сывороток, из второго разведения соответственно во вторые и т.д. (это 
можно выполнять аппаратом Флоринского с мерными пипетками по 0,2 куб.см). 
Первые ряды пробирок с позитивной и испытуемыми сыворотками (взятыми из 
опыта) разливают специфический антиген в рабочем разведении в антигенные 
ряды по 0,2 куб.см, а во вторые ряды - по 0,2 куб.см физраствора. Пробирки 
встряхивают и ставят в водяную баню на 60 мин. при 37-38 °С.

Затем во все пробирки разливают гемолитическую ситему по 0,4 куб.см, 
встряхивают и ставят в водяную баню на 20 мин при 37-38°С (схему 
титрования комплемента см. в таблице 1).

Титром (единицей) комплемента считают наименьшую дозу его, которая дает 
полный гемолиз эритроцитов с испытуемыми сыворотками в пробирках первого и 
второго рядов и позитивной сывороткой - в пробирках второго ряда (без 
антигена).

В примере, приведенном в таблице 2, титр комплемента, разведенного 1:20, 
равен 0,1 куб.см, что и будет является его рабочей дозой.

Примечание: если в первом ряду пробирок с сыворотками из опыта получена 
ясно выраженная задержка гемолиза эритроцитов более, чем на два интервала 
по сравнению с безантигенным рядом, это значит, что испытуемые сыворотки 
содержат специфические к данному антигену антитела и, в таком случае, 
рабочую дозу комплемента определяют по безантигенным рядам позитивной и 
испытуемых сывороток.

Расчет количества чистого комплемента необходимого для постановки глав- 
ного опыта, делают по формуле:

      А х В 
      -----
        С

где А - рабочая доза комплемента; 
    В - количество пробирок, занятых в реакции; 
    С - основное разведение комплемента.

Пример: (0,1 х 100):20 =0,5.

Количество разведенного комплемента, требуемое для всей реакции (в данном     
примере 100 пробирок), равно 20 куб.см (0,2 х 100), поэтому к 0,5 куб.см 
чистого комплемента следует добавить 19,5 куб.см физиологического 
раствора.

2.7.3. Главный опыт РСК. Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 
1:5 и 1:10 (доза сыворотки 0,04 куб.см и 0,02 куб.см со специфическим 
антигеном, в разведении 1:5 с контрольным антигеном (на специфичность) и 
без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции 
в разведенном виде при 56-65 °С (в зависимости от вида животных) в течение 
30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38 °С, бактериолити-
ческую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической 
системой) - 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

- позитивная сыворотка в разведении 1:5 без антигена и с контрольным ан- 
тигеном; в разведениях от 1:5 до ее титра со специфическим антигеном;

- негативная сыворотка в разведениях 1:5 и 1:10 со специфическим антиге- 
ном, в разведении 1:5 с контрольным антигеном и без антигена - антигены 
специфический и контрольный в двойной дозе - на антикомплементарность 
(комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент -);

- гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент -). 

Схема постановки главного опыта представлена в таблице 3. 

2.8. Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК). 

2.8.1. Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6 °С в течение 
16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38 °С.
Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:30 (при определе- 
нии его рабочего разведения). Если рабочий титр комплемента неизвестен или 
вызывает сомнение, перед титрованием гемолитической системы для РДСК 
определяют его рабочее разведение по схеме, представленной в таблице 4.

2.8.2. Титрование гемолитической системы. Дозу гемолитической системы для 
главного опыта РДСК определяют путем титрования ее на 3-4 сыворотках:
позитивной и 1-2 испытуемых из партии, поступившей на исследование.

Инактивированные сыворотки (позитивную и испытуемые) в разведении 1:5 
разливают каждую в два ряда пробирок штатива Флоринского по 0,2 куб.см. 

Затем в первые ряды пробирок каждой сыворотки вносят по 0,2 куб.см антигена в 
рабочем разведении, а во вторые ряды - 0,2 куб.см физиологического раствора; 
во все пробирки разливают по 0,2 куб.см комплемента в зависимости от его рабо-
чего разведения, встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 
температуре 2-6 °С.

На следующий день штативы вынимают из холодильника и выдерживают в 
течение 20-30 мин. при комнатной температуре.

Затем в первые пробирки с позитивной и испытуемыми сыворотками разливают 
гемолитическую систему (приготовленную согласно пунктам 2.3 и 2.4) по 0,1 
куб.см, во вторые пробирки - по 0,2 куб.см, в третьи - по 0,3 куб.см и 
т.д. до 1 куб.см.

Пробирки встряхивают, ставят в водяную баню на 20 мин. при 37-38 °С, после 
чего определяют титр гемолитической системы.

Схема титрования гемолитической системы представлена в таблице 5.

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в кото- 
ром получен полный гемолиз эритроцитов в обоих рядах пробирок с негативной 
и испытуемой сыворотками и в безантигенном ряду с позитивной сывороткой, 
при полной задержке гемолиза в ряду с позитивной сывороткой и антигеном. В 
приведенном примере (таблица 5) титр гемолитической системы равен 0,6 
куб.см.

2.8.3. Главный опыт РДСК. В первый день одновременно с разливом сывороток 
для титрования гемолитической системы, разливают сыворотки и антиген для 
главного опыта, как указано в пункте 2.7.3.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей раз-
ливают комплемент по 0,2 куб.см в зависимости от его рабочего разведения, 
пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6 °С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после
выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все про- 
бирки разливают гемолитическую систему в дозе, полученной при титровании 
(в приведенном примере - 0,6 куб.см). Штативы встряхивают и помещают в 
водяную баню на 20 мин. при 37-38 °С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 6.

2.9. При массовых постановках РДСК испытуемые сыворотки исследуют только 
со специфическим антигеном в разведении сыворотки 1:5 (0,05 куб.см сыво- 
ротки + 0,2 куб.см физиологического раствора), с последующей перестановкой 
сомнительно и положительно реагирующих проб, как указано в п. 2.7 и 2.8.

Допускается:

- при работе с аппаратом Флоринского для разведения сыворотки 1:5 к 0,05 
куб.см сыворотки добавлять 0,2 куб.см физраствора;

- перед разливом компонентов в РСК и РДСК - смешивание равных объемов 
антигена и комплемента в рабочих разведениях.

2.10. Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз - сразу 
после водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки 
(через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в 
холодильнике от 2° до 6 °С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется 
проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с 
полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее 
готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

"Стандартную " шкалу готовят перед учетом реакции.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем 
сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках и процент ге-
молиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, 
бесцветная;
+++ (3 креста) - гемолиз 25 % эритроцитов;
++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;
+  (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;
- (минус) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость   
интенсивно окрашена гемоглобином.

2.11. Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 (0,04 куб.см, 0,02 
куб.см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена 
и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4  
креста в разведении 1:10.

Сомнительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении 
сыворотки 1:10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1:5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 
1:5и 1:10.

2.12. Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и 
сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики 
для постановки окончательного диагноза.