Продолжение
4. Обнаружение, выделение и идентификация хламидий и антигенов хламидий
4.1. Обнаружение хламидий.
Для обнаружения хламидий из доставленного патологического материала
готовят мазки или мазки-отпечатки для световой и люминесцентной
микроскопии.
4.1.1. Метод световой микроскопии. При исследовании материала методом
световой микроскопии мазки или мазки-отпечатки окрашивают по Романовскому-
Гимзе.
При окраске по Романовскому-Гимзе подсушенные на воздухе препараты
фиксируют 96% этиловым (метиловым) спиртом или охлажденным безводным
ацетоном в течение 5 мин. и окрашивают краской Романовского-Гимзе,
разведенной в соотношении 1:10 фосфатным буфером (рН 7,2-7,6) в течение
1,5 часов, после чего их промывают дистиллированной водой и высушивают
фильтровальной бумагой.
Окрашенные и высушенные препараты просматривают в световом микроскопе под
иммерсионным объективом. Цитоплазматические включения представляют
компактные или рыхло расположенные зернистые массы, содержащие
морфологические структуры возбудителя на разных этапах его размножения.
Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают его к периферии
клетки, имеют разнообразную правильную или неправильную форму, отличаясь
по цвету и внутренней структуре от ядра и цитоплазмы. Мелкие, ранние
включения, содержащие крупные тельца со средним диаметром от 0,5 до 1,2
мкм имеют синефиолетовый цвет, крупные включения, содержащие
преимущественно мелкие зернистые структуры возбудителя имеют розово-
красный цвет. Обычно в одной клетке выявляются включения хламидий разной
степени зрелости и различной плотности расположения. Нередко, при рыхлом
расположении морфологических структур микроорганизма, обнаруживается
содержащая их вакуоль.
4.1.2. Метод прямой и непрямой иммунофлуоресценции (ИФ).
Для исследования методом прямой и непрямой ИФ мазки готовят непо-
средственно после взятия материала с конъюнктивы и гениталий животных, ис-
пользуя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной адсорбцией.
Материал отбирают вращательным движением тампона и переносят на лунку
предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют, указывая номер и
дату взятия пробы. Приготовленный мазок высушивают на воздухе. Высушенный
мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 мин. или наносят на мазок 2-3
капли ацетона до полного его испарения. Стекло с фиксированным препаратом
может храниться при температуре 18-20 °С в течение 5 сут.
4.1.3. Для проведения прямой ИФ используют набор, в состав которого вхо-
дят:
- компонент №1 - лиофилизированные моноклональные антитела, меченные
флюоресцеин-изотиацианатом (ФИТЦ) и содержащие краситель Эванса; сухая
гомогенная аморфная масса синевато-сиреневого цвета -1 флакон, 0,1 куб.см;
- компонент №2 - растворитель для лиофилизированных иммуноглобулинов,
прозрачная бесцветная жидкость -1 флакон, 3,0 куб.см;
- компонент №3 - жидкость для "заключения" препарата, вязкая прозрачная
маслянистая жидкость -1 флакон, 2,0 куб.см.
Оборудование:
- люминесцентный микроскоп;
- термостат на 37 °С;
- чашки Петри;
- предметные стекла с лункой;
- фильтровальная бумага;
- микропипетка на 30 мкл;
- наконечники в штативе.
4.1.4. При исследовании прямым методом ИФ на специальную лунку пред-
метного стекла с фиксированным материалом с помощью микропипетки вносят
30 мкл меченных ФИТЦ моноклональных антител. С помощью наконечника пипет-
ки или запаянной пастеровской пипетки равномерно распределяют реагент по
всей поверхности лунки с материалом.
4.1.5. Инкубация мазков-отпечатков. Мазки с нанесенным на них реагентом
инкубируют во влажной камере (в чашке Петри) при температуре 37±0,5 °С в
течение 30 мин, периодически проверяя их состояние во избежание высыхания
реагента на препарате, что может привести к ложноположительным результатам
при диагностике, поэтому высохшие препараты бракуются.
4.1.6. Промывание предметных стекол. По истечении срока инкубации
предметные стекла тщательно промывают дистиллированной водой в течение
10с, остатки воды удаляют с краев стекла фильтровальной бумагой и
высушивают на воздухе.
4.1.7. Микроскопирование мазков. На мазок наносят 20 мкл жидкости для
"заключения" препарата (компонент №3), покрывают обезжиренным покровным
стеклом и просматривают препарат в люминесцентном микроскопе при комбина-
ции светофильтров С3 24-3, ФС 1-2, БС 8-3 при использовании окуляра Х 10 и
объектива с масляной иммерсией Х 90, с использованием нефлюоресцирующего
иммерсионного масла. Препарат рекомендуется просматривать сразу же после
приготовления. Смонтированные препараты можно хранить при температуре 2-8
°С не более 24 ч.
4.1.8. Учет результатов ПИФ. Диагноз на хламидиоз считается положитель-
ным, если в препарате диагностируют наличие элементарных телец хламидий,
расположенных внеклеточно и представляющих собой ярко-зеленые образования
округлой формы с ровными краями, размером около 300 мкм (приблизительно
1/100 от окружающих эпителиальных клеток). Иногда наблюдаются ретикулярные
тельца хламидий, размеры которых в 2-3 раза больше элементарных.
Внутриклеточные включения выявляются не более, чем в 10% случаев.
Диагноз на хламидиоз считается отрицательным, если в препарате отсутст-
вует специфическое ярко-зеленое свечение при наличии окрашенных в красный
цвет эпителиальных клеток. Для того, чтобы отрицательный диагноз можно
было считать достоверным, рекомендуется просматривать все поле мазка не
менее 5 мин.
В качестве отрицательного контроля проводят микроскопию мазков, приго-
товленных из конъюнктивы заведомо здоровых животных, специфическое ярко-
зеленое свечение при наличии красных эпителиальных клеток должно
отсутствовать.
Любой флюоресцирующий материал неправильной формы или другого цвета, а
также имеющий неяркую зеленую окраску, рассматривается как артефакт.
4.1.9. При исследовании препаратов непрямым методом ИФ на фиксированный
мазок или мазок-отпечаток наносят иммунную хламидийную нефлуоресцирующую
сыворотку и выдерживают его во влажной камере при тех же условиях.
Затем промывают физиологическим раствором и высушивают.
Для контроля на другой препарат наносят контрольную отрицательную сы-
воротку, выдерживают во влажной камере, затем окрашивают флуоресцирующей
антивидовой сывороткой.
При наличии в препаратах антигена хламидий обнаруживают специфическое
свечение в виде желто-зеленых гранул округлой и овальной формы на тусклом
зеленовато-сером фоне. В контрольном препарате специфическое свечение
должно отсутствовать.
5. Выделение хламидий.
Выделение хламидий проводят на куриных эмбрионах или лабораторных
животных.
5.1. Для заражения эмбрионов из патологического материала готовят 10%
суспензию на физиологическом растворе рН 7,2-7,4 и центрифугируют ее при
2000 об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками: 10
ед/куб.см пенициллина и 500 ед/куб.см стрептомицина или 150 мкг/куб.см
гентамицина.
Пробы спермы, эякулята, влагалищной слизи используют в цельном виде
или разводят (1:2), которые обрабатывают вышеуказанными антибиотиками. За-
тем выдерживают в холодильнике при 4 °С в течение 2-4 час и высевают на
питательные среды (МПБ, МПА) для исключения бактериального загрязнения.
Через сутки при отсутствии роста микрофлоры на питательных средах,
исследуемый материал вводят 6-7 дневным куриным эмбрионам в желточный
мешок в дозе 0,2 куб.см. Каждым материалом заражают не менее 6 эмбрионов.
Эмбрионы инкубируют в термостате при 37 °С и относиттельной влажности 75%.
Гибель эмбрионов в течение 72 час после заражения считают неспецифической.
При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 12 день вскрывают и
проводят следующий пассаж по общепринятой методике, используя для зараже-
ния центрифугат 10% суспензии желточных мешков.
Эмбрионы, погибшие на 4-12 день после заражения, вскрывают. Аллантоисную
жидкость проверяют на бактериальную контаминацию путем высева на пи-
тательные среды (МПБ, МПА). Желточные мешки эмбрионов отбирают в стериль-
ную посуду и из каждого готовят мазки-отпечатки.
Результаты исследования считают положительными в случае обнаружения
и идентификации хламидий или их антигенов или ДНК хламидий в желточных
мешках куриных эмбрионов, павших на 4-12 день после заражения, в любом из
трех последовательных пассажей.
5.2. Для культивирования хламидий используют перевиваемые культуры клеток
(mccoy, l-929, hela). Заражение культуры проводят соскобным материалом,
полученным со слизистых оболочек или суспензией из паренхиматозных
органов. Первичный инфекционный материал помещают во флаконы со
стеклянными бусами, содержащими 2 куб.см 199 среды с 5% фетальной
сывороткой крупного рогатого скота и 5% 0,5 М раствором глюкозы. Для
подавления сопутствующей бактериальной флоры в инфекционный материал
добавляют стрептомицин (200 мкг/ куб.см), канамицин (100 мкг/мл) и
нистатин (25 мкг/мл). Экспозиция с антибиотиками продолжается от 3 до 18
часов при температуре 4° С, в отдельных случаях материал до заражения
хранят при минус 70° С. Обработанный антибиотиками материал вносят по 0,3
куб.см в 4-5 плоскодонные пробирки с монослоем клеток, выращенные на
покровных стеклах и предварительно обработанные ДЕАЕ-декстраном (90 мкг)
на 30 мин, центрифугируют при 2400 об/мин в течение 1 часа при температуре
(33-34)° С. Инокулят удаляют, культуру заливают свежей средой того же
состава и инкубируют при температуре 35° С. Индикацию хламидий проводят
через 48, 72 часа, а в отдельных случаях через 24 часа. С этой целью
покровные стекла извлекают из пробирок, фиксируют в 96° этаноле в течение
10-15 мин. и окрашивают по Романовскому-Гимзе или моноклональными
антителами в тот же день или хранят не более недели при температуре (4 ±
2)°С. Аналогичным образом готовят препараты из неинфицированных клеток.
Результаты исследования считают положительными в случае обнаружения
специфических включений хламидий или их антигенов в инфицированной
культуре клеток. В препаратах из неинфицированной культуры клеток
специфические включения хламидий или их антигены должны отсутствовать.
5.3. Для выделения хламидий на лабораторных животных заражают 5 белых
мышей массой 16-20 г или 2-3 морских свинок массой 300-350 г.
Материал, подготовленный, как описано в пункте 5.1, вводят внутрибрюшинно
или интраторакально (в грудную полость через межреберные ткани с правой
стороны) белым мышам в дозе 0,3 куб.см, морским свинкам - 0,5 куб.см.
Животные находятся под наблюдением до 10 дней. При наличии в материале
патогенных хламидий животные заболевают и через 7-10 дней после заражения
погибают. При вскрытии павших животных обнаруживают значительное
количество серозно-фибринозного экссудата в грудной и брюшной полостях,
очаговую пневмонию, точечные кровоизлияния под легочной плеврой.
На 10 день после заражения (при отсутствии гибели) животных убивают и
проводят следующий пассаж на этом же виде животных по общепринятой мето-
дике, используя для заражения центрифугат 10% суспензии из паренхиматозных
органов.
Результаты исследования считают положительными в случае обнаружения
и идентификации хламидий или их антигенов или ДНК хламидий в
патологическом материале от животных, павших на 7-10 день после заражения,
в любом из трех последовательных пассажей.
6. Выявление ДНК хламидий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
6.1. Метод предназначен для выявления ДНК chlamydia с помощью ПЦР в
патологическом материале от животных. В основе метода лежит многократное
повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 95
°С, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) при
температуре 62 °С и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента
при температуре 72 °С.
6.2. В ПЦР используют следующие наборы:
- набор для выделения ДНК (набор № 1);
- набор для проведения ПЦР (набор № 2);
- набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР(набор № 3);
- набор контрольных образцов (набор №4).
6.2.1. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
- лизирующий раствор -1 пробирка, 30 куб.см;
- отмывочный раствор №1-1 пробирка, 20 куб.см;
- концентрат для отмывочного раствора №2 -1 пробирка, 20 куб.см;
- суспензия сорбента - 2 пробирки по 2 куб.см;
- буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5 куб.см.
6.2.2. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:
- смесь праймеров "chla" -1 пробирка, 0,25 куб.см;
- смесь нуклеотидов -1 пробирка, 0,25 куб.см;
- 5-кратный реакционный буфер -1 пробирка, 0,5 куб.см;
- деионизованная вода -1 пробирка, 1 куб.см;
- фермент taq-полимераза -1 пробирка, 0,05 куб.см;
- воск для ПЦР -1 пробирка, 1,0 куб.см;
- масло минеральное -1 пробирка, 5,0 куб.см.
6.2.3. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из
следующих компонентов:
- концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25 куб.см;
- агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2 г.
6.2.4. Набор контрольных образцов состоит из следующих компонентов:
- ОКО (отрицательный контрольный образец) -1 пробирка, 1 куб.см;
- положительный контрольный образец для ПЦР- К+ ДНК (ДНК chlamydia
psittaci) - 1 пробирка, 0,1 куб.см.
6.3. Отбор материала для исследования
6.3.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для
исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение
объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и
инструкциями по данному вопросу.
6.3.2. Для исследования используют:
- паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, ку-
сочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух
сторон сычуг аборт-плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу
от производителей, подозрительных по заболеванию, соскобы слизистых
оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта).
6.3.3. Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 куб.см, из тканей и
органов вырезают кусочки размером 3х3х3 см3 (при невозможности толщина
кусочков может быть меньше).
6.3.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на сле-
дующий день, сохраняя при 4 °С. Допускается хранение материала при минус
20 °С в течение 30 дней. Пробы мочи доставляют в тот же день.
6.4. Подготовка исследуемого материала.
6.4.1. Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипе-
точными дозаторами переменных объемов (типа "Ленпипет") с использованием
одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 куб.см и 10,0 куб.см (ПО
"Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая
пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в
специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной
извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.
6.4.2. Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 куб.см центрифугируют при
3000 об/мин в течение 10-15 мин. При необходимости объем проб доводят до
требуемого путем добавления физиологического раствора. Супернатант
осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,2 куб.см жидкости. Если
осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 куб.см
материала и повторяют центрифугирование. Осадок суспендируют в оставшейся
надосадочной жидкости (или физиологическом растворе) и 100 мкл его
используют для выделения ДНК.
6.4.3. Пробы паренхиматозных органов, плодовых оболочек, размером 3х3х3
куб.мм помещают в пробирки типа "эппендорф", тщательно растирают
отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 куб.см физиологического
раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при температуре 20-25
°С в течение 20 мин, после чего 100 мкл верхней фазы используют для
выделения ДНК.
6.4.4. Сперму в объеме 0,5 куб.см разводят равным объемом физиологического
раствора, осаждают на микроцентрифуге при 10000-12000 об/мин в течение 8-
10 мин, осадок ресуспендированный в 100 мкл физиологического раствора
используют для выделения ДНК.
6.4.5. Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 куб.см
физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11000-12000
об/мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок
ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для
выделения ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие
наконечника пипетки), то пробу обрабатывают 1-2 куб.см раствора 0,1М
меркаптоэтанола, добавив его в "эппендорф". Размешивают на вортексе,
выдерживают при комнатной температуре 3-5 мин. и центрифугируют в
вышеуказанном режиме. Осадок в 100 мкл физиологического раствора исполь-
зуют для выделения.
6.5. Проведение ПЦР-анализа.
6.5.1. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях(зонах),
для работы в которых дополнительно требуются следующие материалы и
оборудование:
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1:
- настольный бокс с бактерицидной лампой;
- термостат для пробирок типа "эппендорф" на 25-100 °С;
- микроцентрифуга до 12000-16000 об/мин;
- центрифуга/вортекс "Микроспин";
- отдельный набор автоматических пипеток переменого объема от 0,001 куб.см
до 1 куб.см;
- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером;
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 куб.см типа "эппендорф" ;
- штативы для пробирок, наконечников;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- холодильник на 2-8 °С с морозильной камерой
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2:
- амплификатор;
- ПЦР-бокс или отдельный стол с УФ-лампой;
- отдельный халат и одноразовые перчатки;
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от 0,001
куб.см до 1 куб.см;
- одноразовые наконечники в штативах;
- одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 куб.см;
- штативы для микропробирок на 0,5 куб.см;
- холодильник на 2- 8 °С, морозильник на минус 20 °С для выделенных ДНК;
- термостат для микропробирок с воском на 95 °С.
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3;
- камера для горизонтального электрофореза;
- источник постоянного тока на 150-200 В;
- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей;
- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка;
- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
- аквадистиллятор;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;
- мерный цилиндр на 1л;
- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
6.5.2. Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала.
Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного материала проводят с помощью
набора №1. Предварительно готовят отмывочный раствор №2, смешав в от-
дельном флаконе 20 куб.см концентрата из набора, 80 куб.см
дистиллированной воды и 100 куб.см 96% этилового спирта. Смесь хорошо
перемешивают и хранят при температуре 20-22 °С под плотно закрытой
крышкой.
Проверяют состояние сорбента - при отстаивании он должен занимать
приблизительно половину объема суспензии. После этого приступают к выделе-
нию ДНК.
В ряд полипропиленовых пробирок объемом 1,5 куб.см вносят по 100 мкл пред-
варительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контрольных
проб 1-го этапа анализа ("контролей выделения"): отрицательные пробы -
элюирующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае
подготовки пробы с его использованием), положительная проба - ДНК
chlamydia (из набора №4), разведенная 1:10 элюирующим буфером. Добавляют
по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником с
аэрозольным барьером) и тщательно пипетируют 5-10 раз до полного лизиса
пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор. Прогревают пробирку 5 мин.
при 65 °С, тщательно перемешивают на вортексе до полного растворения
материала. Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в
каждую пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают содержимое
пробирки на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин. для осаждения
сорбента, еще раз перемешивают и отстаивают 5-7 мин. Осаждают сорбент на
"Микроспине" в течение 30 сек. и отбирают супернатант из каждой пробирки
отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос с колбой-
ловушкой для отбираемой жидкости).Добавляют по 200 мкл отмывочного
раствора №1, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования (если
сорбент плохо разбивается, тогда его разбивают при помощи наконечника
пипетки), осаждают на "Микроспине" в течение 30 с и отбирают супернатант.
Добавляют по 800 мкл отмывочного раствора №2, перемешивают на вортексе до
полного ресуспендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10000
об/мин в течение 30 с, отбирают супернатант. Повторяют процедуру отмывки
раствором №2, тщательно отбирают супернатант и высушивают осадок сорбента
при открытых крышках пробирок в термостате при 65 °С, в течение 5-7 мин.
Добавляют 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в термостат
при 65 °С на 5 мин, встряхивая на вортексе через каждую минуту. Осаждают
на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение минуты. Проба готова к
постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.
Подготовить положительный контрольный образец для ПЦР, для чего развести
К+ ДНК в 100 раз в буфере для элюции ДНК и вместе с ДНК-пробами перенести
в комнату для постановки ПЦР.
ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).
Пробирку с воском ставят в термостат при 95 °С до полного расплавления.
Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя стерильные наконечники
(полистирол выдерживает автоклавирование при 120 °С):
- для амплификации ДНК chlamydia: к 0,25 куб.см праймеров "chla" добавляют
0,25 куб.см нуклеотидов, смешивают на вортексе;
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают
сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл
жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых наносят пометки
"chla". Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри,
прогревают пробирки в амплификаторе 5 мин. при 95 °С и охлаждают. В таком
виде пробирки хранятся в морозильнике несколько месяцев, можно приготовить
сразу 50-100 штук.
Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 куб.см 5-кратного реакционного буфера
добавляют 0,45 куб.см деионизованной воды и 0,05 куб.см taq-полимеразы,
хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2-8°С в течение месяца
(не замораживать!). Выставляют ряд пробирок с "нижними" смесями ("chla") в
штатив по числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа
("контроли выделения"), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР"
(деионизованная вода и ДНК chlamydia, разведенные деионизованной водой
1:10), нумеруют их. Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10
мкл "верхней" смеси, при этом она не должна проваливаться под воск и
смешиваться с "нижней" смесью. Сверху раскапывают по 1 капле масла. Под
масло вносят по 10 мкл проб - испытуемых и контрольных и 10 мкл К+ ДНК,
подготовленной для постановки ПЦР, т.е. разведенной 1:100 буфером для
элюции. Для отрицательного контроля амплификации вместо ДНК-пробы
добавляют 10 мкл деионизованной воды (из набора №2).
Набирают на амплификаторе нужную программу:
Амплификаторы с регулиро-
ванием температуры по матрице
(скорость нагрева-охлаждения - не
менее1° С/сек):
"minicycler", "РТС-100" (mj re-
search)
|
Амплификаторы с активным
регулированием по раствору в
пробирке):
"geneamp psr system 2400" (per-
kin elmer); "omn-e" (hibaid); "Терцик"
(ДНК-технология)
|
95 °С- пауза
95 °С - 2мин. 1 цикл
95 °С - 45 с
62 °С - 45 с 40циклов
72 °С - 45 с
10 °С -12-14 час (хранение)
|
95 °С- пауза
95 °С - 2мин. 1 цикл
95 °С - 10с
62 °С - 10с 40циклов
72 °С - 10с
10 °С -12-14 час (хранение)
|
Через 1-2 мин. после запуска программы, (когда температура в ячейке
амплификатора достигнет 95 °С), ставят программу на паузу, помещают
пробирки в ячейки, закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут
окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с регулированием
температур по матрице и 1 час 40 мин. на амплификаторе с активным
регулированием). После окончания реакции (в тот же день или после хранения
утром следующего дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в
комнату для анализа продуктов ПЦР, который проводится разделением
фрагментов ДНК в агарозном геле.
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:
chlamydia - 300 п.н.
ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.
Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной комнате
лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в пре-
ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических лабораториях,
использующий метод полимеразной цепной реакции. Основные положения,
утвержденные Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 27
января 1997 г. № 13-7-2/840).
В мерный цилиндр наливают 25 куб.см концентрированного буфера, доводят
дистиллированной водой до 500 куб.см, закрывают цилиндр парафинированной
пленкой ("parafilm") и перемешивают. Агарозу из одной пробирки набора
пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого стекла объемом 250 куб.см,
наливают 100 куб.см готового буфера и плавят на кипящей водяной бане до
полного растворения агарозы, после этого кипятят агарозу еще 20 мин. и
немного остужают, вращая колбу. Заливают агарозный гель в форму (толщина
5-6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга.
После полного застывания геля (30 мин. при комнатной температуре)
осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают полосу готового
геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены в сторону
отрицательного электрода (ДНК из лунок будет двигаться к положительному
электроду). Наливают приготовленного буфера столько, чтобы он покрыл гель
на 4-5 мм. Выставляют пробирки с продуктами амплификации последовательно в
штатив. Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно
лунки. Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1-2
раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет
нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны
подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см
до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину
длины геля. Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор,
расположив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок
(одна под другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК
под ультрафиолетовым излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены
специальной маской или стеклянной пластиной).
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в проходящем
ультрафиолете на чувствительную пленку типа "Микрат 300" или поляроидную
пленку. Документирование результатов можно проводить с помощью других
систем: insta doc i, insta doc ii (фотографирующие), gel doc 1000 или
Шатер ДВ (компьютерные).
6.5.3. Учет и интерпретация результатов.
В дорожке соответствующей положительному контрольному образцу должна
быть яркая специфическая светящаяся оранжевая полоса на уровне 300 п.н.
Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую
светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне 300 п.н.
В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу не должно
быть каких-либо полос. Отрицательными считаются образцы, которые не
содержат специфической полосы 300 п.н.
Кроме полосы 300 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые пятна
праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п. (в нижней
части дорожки).
При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует большое
количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля
появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до
самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого
шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в
отрицательном образце полоса отсутствует.
Результаты анализа не учитываются, если:
- в дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повторить
исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на
первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой
очистке от ингибиторов реакции.
- в дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая
полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб
положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК
в процессе работы. Для проверки реактивов необходимо поставить не
менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько
же на этапе постановки ПЦР для выявления источника контаминации.
Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы.
- в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях.
Возможные причины: неправильное проведение "горячего старта" или
неверный температурный режим в ячейках амплификатора.
7. Диагноз на хламидийные инфекции считают предварительным:
- при выявлении специфических антител в сыворотке крови в РСК (РДСК)
или ИФА;
Диагноз на хламидийные инфекции считают окончательным при применении
любого прямого метода диагностики, который выявляет:
- хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом материале.
8. Сроки исследований:
- выявление специфических антител - от 1 до 5 дней;
- световая микроскопия - от 30 мин до 2 час;
- люминесцентная микроскопия - около 40 мин;
- выделение и идентификация хламидий - от 7 до 30 дней;
- выявление ДНК хламидий - от 4 до 5 час.
С утверждением настоящих методических указаний утрачивают силу
"Методические указания по лабораторным исследованиям на хламидийные
инфекции сельскохозяйственных животных", утвержденные Главным
управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР от 15
апреля 1986 года.
Разработчики методических указаний по лабораторным исследованиям на
хламидийные инфекции животных:
1. Белоусов В. И. - начальник отдела Департамента ветеринарии;
2. Груздев К. Н.-зав. отделом ВГНКИ;
3. Обухов И.Л. - вед. н.с. ВГНКИ;
4. Сидоркина Т. И. - зав. отделом ЦНМВЛ;
5. Виткова О.Н. - зав. отделом ЦНМВЛ;
6. Орел Н.Г. - ветврач ЦНМВЛ
.gif)