Продолжение
4.3.3.2. Среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфитный агар
выпускаются в сухом виде. Способ приготовления указан на этикетке.
4.3.4.
Среды для первичной идентификации.
4.3.4.1. Комбинированная среда по Олькеницкому:
агар питательный сухой - 25 г
лактоза - 10 г
аммоний-железо (2) сульфат - 0,2 г
натрия тиосульфат - 0,3 г
мочевина - 10 г
феноловый красный ( 0,4%-ный водный раствор) - 4 см куб
вода дистиллированная - 1000 см куб
Приготовление: соли предварительно растворяют в небольшом объеме
дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в неболь-
ших объемах воды при подогревании в водяной бане. Сухой питательный
агар расплавляют в оставшемся объеме воды при нагревании и помешива-
нии. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным
агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4,
до-
бавляют индикатор и разливают в пробирки по 6-7 см куб. Среду стерили-
зуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин и скатывают оставляя столбик
2,2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.
4.3.4.2. Агар Клиглера.
Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями
на
этикетке препарата. Готовая к употреблению среда имеет красновато-бу-
рый или оранжево-красный цвет, при скатывании следует оставлять стол-
бик высотой 2-2,5 см.
4.3.4.3. Среда Ресселя.
Приготовление среды Ресселя (сухой) указано на этикетке.
4.3.5. Среды
и реактивы для биохимической дифференциации сальмо-
нелл.
4.3.5.1. Среды Гисса (среды с углеводами)
Выпускаются коммерческие сухие среды с углеводами (глюкозой, лак-
тозой, мальтозой, сахарозой и маннитом). Их приготовление указано
на
этикетке.
4.3.5.2. Реактив Эрлиха (на индол).
Взвешивают 5 г пара-диметиламидобензальдегида в стеклянном стака-
не вместимостью 100 см куб, помещают в коническую колбу вместимостью
200 см куб и растворяют в 50 см куб этилового спирта. С помощью мерно-
го цилиндра вместимостью 100 см куб медленно добавляют 50 см куб кон-
центрированной соляной кислоты. Раствор хранят в колбе с притертой
пробкой при температуре 4 гр. С.
4.3.5.3. Реактив Ковача (на индол).
В 75 см куб амилового спирта растворяют 5 г парадиметиламидобен-
зальдегида, затем медленно добавляют 25 см куб концентрированной соля-
ной кислоты. Реактив хранят в колбе с притертой пробкой из темного
стекла при температуре 4-8 гр.С.
4.3.5.4. Приготовление индикаторной бумаги для определения серо-
водорода.
В 100 см куб дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого
свинца в 1 г углекислого натрия. Затем раствором пропитывают полоски
фильтрованой бумаги, высушивают их при температуре 18-23 гр.С и наре-
зают на узкие полоски. После приготовления бумага остается белой;
при наличии сероводорода чернеет.
4.3.б. Агглютинирующие
сальмонеллезные сыворотки
Необходимые разведения сыворотки готовят перед использованием
согласно прилагаемой к коробке инструкции.
4.4. Питательные
среды и реактивы для определения сульфитредуци-
рующих клостридий
4.4.1. Среда Китт-Тароцци:
мясо-пептонный бульон - 1000 см куб
глюкоза - 10 г
агар - 1,5 г
кусочки печени, или рыбы, или мяса вареные - 1 см куб
Приготовление: стерильные пробирки заполняют на 1-1,5 см кусочками
вареной печени, или мяса, или рыбы и заливают приготовленным мясо-
пептонным бульоном с глюкозой и агаром (в 1000 см куб НПБ вносит 10г
глюкозы и 1,5 г агара, который при нагревании постепенно расплавля-
ют). Высота слоя ЧПБ в пробирках 12-13 см. Пробирки со средой стерили-
зуют 20 мин при 121 гр.С. рН среды после стерилизации должен быть 7,1.
При приготовлении среды впрок вместо добавления к ней агара
на
поверхность среды перед стерилизацией в пробирки наслаивают 0,5-1,0
см
вазелинового масла.
При применении среды Китт-Тароцци без добавления в нее агара
или
вазелинового масла на поверхность среды после окончания посева наслаи-
вают голодный агар или парафиновую смесь высотой 1,0 - 1,5 см.
При посевах в свежеприготовленную среду Китт-Тароцци (не более
3
сут с момента приготовления) добавлять агар, вазелиновое масло
или
наслаивать на ее поверхность голодный агар не обязательно.
4.4.1.1. Приготовление вареной говяжьей печени:
500 г говяжьей печени режут на куски массой по 30-40г, заливают
водой и кипятят в течение 15-20 мин. Воду сливают, куски печени разре-
зают на кусочки массой 1,5-3,0 г, заливают водой, подщелоченной двууг-
лекислым натрием до рН 7,2-7,4 и кипятят, не допуская бурного кипения.
Общее количество добавленной воды 1000 см куб. Затем печень промывают
в дуршлаге под струей воды в течение 1 ч и два-три раза дистиллирован-
ной водой.
Кусочки печени раскладывают во флаконы, заливают водой и стерили-
зуют 20 мин при 120 гр.С.
4.4.1.2. Масло вазелиновое.
Масло разливают по 20-50 см куб. в пробирки или колбы и стерили-
зуют 20 мин при 120 гр.С.
Применяют для наслаивания на жидкие питательные среды для анаэ-
робных микроорганизмов.
4.4.1.3. Агар голодный.
2,0 г агара растворяют в 98 см куб дистиллированной воды, стери-
лизуют 20 мин при 120 гр.С
4.4.1.4. Парафиновая смесь.
Растапливают равные количества парафина и вазелинового масла,
смешивают и стерилизуют горячим воздухом при температуре 140 гр
С в
течение 60 мин.
Применяют для наслаивания на жидкие питательные среды для анаэ-
робных микроораганизмов.
4.4.2. Среда Вильсон-Блера.
На дистиллированной воде готовят 20%-ный раствор серноватистокис-
лого натрия и 8%-ный раствор хлористого железа. Оба раствора кипятят.
100 см куб 3%-ного мясо-пептонного агара растапливают на водяной
бане и добавляют 1 г глюкозы, 10 см куб 20%-ного раствора серноватис-
токислого натрия и 1 см куб 8%-ного раствора хлористого железа. Среду
разливают в пробирки по 7 см куб.
4.4.3.
Среда Вильсон-Блера (иодифицированная для анаэробов).
мясо-пептонный агар с 1% глюкозы - 100 см куб
натрий сернистокислый 20%-ный раствор - 10 см куб
железоаминные квасцы 5%-ный раствор - 1,0 см куб
К расплавленному и охлажденному до 80 гр.С мясо-пептонному агару
с глюкозой добавляют асептически растворы сернистокислого натрия и
желе-
зоаминных квасцов (растворы сернистокислого натрия и квасцов при тем-
пературе (115+1) гр.С 30 мин, либо готовят на горячей (75+5) гр С сте-
рильной дистиллированной воде; растворы хранения не подлежат). рН
го-
товой среды при 25 гр.С составляет 7,7+0,1. Среду разливают по (18+2)
см куб в чашки Петри и используют после застывания и подсушивания
при
температуре (37+1)гр С в течение 3-4 ч.
4.4.4. Среда Роберта.
бульон мясо-пептонный стерильный - 25 см куб
желатин - 30 г
агар - 1 г
калий фосфорно-кислый двузамещенный - 2 г
калий азотнокислый - 2 г
2,3,5-трифенилтетраэодиум хлорид, 1%-ный - 10 см куб
водный раствор
В воду вносят фосфорнокислый калий, азотнокислый калий, агар
и
желатину, дают набухнуть желатину и нагревают на водяной бане до пол-
ного растворения желатина и агара, добавляют стерильный мясо-пептонный
бульон и 1%-ный раствор 2,3,5-трифенилтетраэолиум хлориде (1
г
2,3,5-трифенилтетраэолиум хлорида вносят в мерную колбу вместимостью
100 см куб, доводят объем дистиллированной водой до метки). Устанавли-
вают рН среды таким образом, чтобы после стерилизации он составлял
при
25 гр.С 7,1+0,1. Стерилизуют трое суток подряд при температуре (100+1)
гр.С 20 мин, либо однократно при температуре (110+1)гр С 15 мин. Гото-
вая среда должна быть бесцветной. Среду хранят при температуре
(3+2)гр.С не более 7 дней.
4.4.5. Среда
сульфитжелезная полужидкая
МПБ - 100 см куб
дрожжевой экстракт сухой или - 1 г
- " - жидкий - 5 г
сульфит натрия водный раствор - 1 см куб
(допускается заменить сульфит натрия
на гипосульфит натрия
в количество 1 г на 1000 см куб среды;
цитрат железа;в тех же концентрациях)
железо лимоннокислое (цитрат) 5%-ный - 1 см куб
водный раствор
К МПБ добавляют дрожжевой экстракт и агар, устанавливают рН таким
об-
разом, чтобы после стерилизации его показатель составлял при 25 гр
С
7,1+0,1 и стерилизуют при температуре (121+1)гр С 15 мин.После стерили-
зации и регенерации добавляют горячие (70-80) гр С растворы сульфита
натрия и лимоннокислого железа, стериллизованные или приготовленные
на стерильной дистиллированной воде. Среду перемешивают, разливают
в
пробирки по 10-12 см куб и используют для посева.
4.4.6. Среда
улучшенная клостридиальная (r.С.М.).
мясной экстракт - 10 г
дрожжевой экстракт сухой или - 3 г
- " - жидкий - 15 г
крахмал растворимый - 1 г
глюкоза - 5 г
хлорид натрия - 5 г
гидрохлорид -цистеина - 0,5 г
уксуснокислый натрий безводный или - 3 г
уксуснокислый натрий водный - 5 г
агар - 15 г
В воде растворяют все ингредиенты при нагревании, охлаждают
до
(50+5)гр С, устанавливают рН таким образом, чтобы он составлял при
25
гр С 7,0+0,1, разливают в пробирки стерилизуют при температуре
(115+1)гр С 20 мин. Среду перед высевом регенерируют. Хранят при тем-
пературе (6+2)гр С не более 7 дней.
4.5.
Среды для определения бактерий рода протей.
4.5.1. Среда жидкая ослективная (Калины Г. и Комаровой Ж)
Основа среды; к 1 дм куб мясо-пептонного бульона добавляют
1 г
манита, 50 см куб натуральной бычьей желчи или эквивалентное количест-
во сухой желчи, 0,8 г калия гидроортофосфата, 2 см куб раствора крис-
таллического фиолетового приготовленного: 11 г/дм куб 0,1 г кристалли-
ческого фиолетового переносят в мерную колбу вместимостью 100 см куб,
растворяют в дистиллированной воде; раствор доливают до метки), 2
см
куб спиртового раствора бромтимолового синего (1,6 г бромтимолового
синего переносят в мерную колбу вместимостью 100 см куб и растворяют
в
96% этанол; раствор доливают до метки этанолом).Устанавливают рН таким
образом, чтобы после стерилизации он составлял 6,9+0,1 при 25гр С.
Стерилизуют текучим паром 100 гр.С в течение 15 мин.
Для приготовления среды к основе добавляют 10 см куб раствора
мо-
чевины (50 г мочевины на 100 см куб дистиллированной воды, раствор
до-
ливают до метки) и 100 000 ВД полимиксина В сульфата или 120 000
ЕД
полимиксина М сульфата. Среду заливают в стерильные пробирки по 5
см
куб. Хранят при (3+2) гр.С не более 7 суток. Готовая среда прозрачная,
желто-бурого цвета.
Дифференциально-диагностические плотные среды.
4.5.2.
Агар дезоксихолат-цитрат лактозный по
в модификации hyres.
Основа среды: в 1 дм куб кипящей мясной воды растворяют 5 г пеп-
тона, 10 г лактозы, 22,5 г агара, охлаждают до (45-50) гр С, устанав-
ливают рН таким образом, чтобы при 25 гр С он составлял 7,4+0,1. При-
бавляют 0,03 г нейтрального красного, разливают мерно по колбам, сте-
рилизуют при (115+1) гр С в течение 20 мин. Хранят при температуре
(3+2)гр С не более 7 суток.
Для приготовления питательной среды к расплавленной и охлажденной
до 45-50 гр С основе прибавляют из расчета на 100 см куб основы
5 см куб. раствора солей (17 г натрия цитрата, 1 г натрия тиосульфата,
2 г цитрата железа помещают в мерную колбу вместимостью 100 см куб.
растворяют в дистиллированной воде; раствор доводят до метки и выдер-
живают на водяной бане при (60+1) гр С в течение 1 ч; раствор хранят
при комнатной температуре не более 3 мес), и 5 см куб раствора дезок-
сихолата натрия (10 г натрия дезоксихолата переносят в мерную колбу
вместимостью 100 см куб., растворяют в дистиллированной воде, раствор
доливают до метки и выдерживают на водяной бане при (60+1) гр С в
те-
чение 1 ч, раствор хранят при комнатной температуре не более 3 мес.).
Среду перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петра по ГОСТ
26670. Среду используют в день ее приготовления.
4.5.3. Агар
дифференциально-диагностический (Калина Г. и
Комаровой Л.).
К 1 дм куб расплавленного мясо-пептонного агара добавляют 15
см
куб. дрожжевого экстракта, 10 г маннита, 10 г мальтозы, 80 см куб.
на-
туральной бычьей желчи или эквивалентное количество сухой желчи,
2 г
железо (3) цитрата, 0,05 г натрия тиосульфата, 0,5 см куб раствора
кристаллического фиолетового, 2 см куб щелочного раствора фенолового
красного (щелочной раствор фенолового красного массовой концентрацией
16 г/дм куб, 1,6 г фенолового красного растворяют в черной колбе вмес-
тимостью 100 см куб в растворе натрия гидроокиси массовой концентраци-
ей 100 г/дм куб, раствор доливают раствором натрия гидроокиси до мет-
ки); раствор антибиотика (раствор полимиксин В сульфата или полимиксин
М сульфата готовят непосредственно перед использованием, для этого
во
флакон со стерильным антибиотиком вносят 5 или 10 см куб стерильной
дистиллированной воды и 120 000 ЕД полимиксино М сульфата или 100
000
ЕД полимиксина В сульфата).
Среду стерилизуют текучим паром (при 100 гр С) в течение 15 мин
и
разливают после охлаждения по стерильным чашкам Петри. Среду хранят
при (4+2) гр С не более 7 суток. Готовая среда оранжево-красного цвета.
4.5.4. cреда для распознания
фениладанина.
15 см куб. дрожжевого экстракта, 2 г Д - фениладанина фосфорно-
кислого двузамещенного, 5 г натрия хлорида, 12 г агара растворяют
кипящей дистиллированной воде. По 5 см куб среды разливают в пробирки,
стерилизуют при (121+1) гр.С 10 мин, дают застыть в наклонном положе-
нии. Среду хранят при (3+2)гр.С не более 7 суток.
4.5.5. Раствор хлорного железа.
массовой концентрацией 100 г/дм куб.; 16,6 г (feci 6Н О) пере-
3 2
носят в мерную колбу вместимостью 100 см куб, растворяют в дистиллиро-
ванной воде. раствор доливают до метки.
4.5.6.
Агар тройной сахарный с цитратом железа.
В 1 дм куб. мясо-пептонного бульона растворяют при нагревании
15
см куб дрожжевого экстракта, 10 г лактозы, 10 г сахарозы, 1 г глюкозы,
0,3 г железа (111) цитрата, 0,3 г натрия сульфата, 0,024 г фенолового
красного, 15 г агара. Устанавливают рН таким образом, чтобы после сте-
рилизации он составлял при 25 гр.С 7,4+0,1. Разливают в пробирки по
10
см куб к стерилизации при температуре (121+1)гр.С в течение 10 мин,
дают застыть в наклонном положении, чтобы максимальная высота столбика
составляла 2,5 см. Среда имеет коричнево-красную окраску. Хранят
при
комнатной температуре не более 7 суток.
4.6. Среды
и реактивы для обнаружения плазмокоагулирующих стафи-
лококков
4.6.1. Солевой бульон.
К 100 см куб. мясо-пептонного бульона (МПБ) с рН 7,2-7,4 в колбе
вместимостью 200 см куб. добавляют 6,5 г хлористого натрия и разливают
в пробирки по 10 см куб. Стерилизуют в автоклаве при 121 гр.С в тече-
ние 20 мин.
4.6.1.1. Мясо-пептонный бульон
по п.4.1.2.
4.6.2. Желточно-солевой
агар (НСА).
Основа - солевой агар: к мясо-пептонному бульону МПБ с рН 7,2-7,4
добавляют 2% агара и 6,5% хлористого натрия, расплавляют на водяной
бане, при необходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разли-
вают мерным цилиндром по 100 см куб. в колбы вместимостью 250 см куб
и
стерилизуют при 121 гр.С в течение 30 мин. Получают солевой агар.
Вместо мясо-пептонного бульона можно использовать сухой питательный
агар, добавив к нему 6,5% хлористого натрия.
НСА: на 100 см куб. стерильного расплавленного и остуженного
до
45гр.С солевого агара добавляют 20 см куб эмульсии яичного желтка.
После полного размешивания желточно-солевой агар разливают в стериль-
ные чашки Петри по 20-25 см куб и хранят в холодильнике до 5-7 дней.
4.6.2.1. Эмульсия яичного желтка.
На дно стерильной чашки Петри помещают куриное яйцо, которое тща-
тельно протирают ватой, смоченной этиловым спиртом. Стерильным пинце-
том пробивают с двух противоположных сторон яйца два отверстия. Через
одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, нес-
колько увеличив отверстие, заливают желток в стерильную колбу вмести-
мостью 200 см куб. К желтку постепенно добавляют (частями по 20-30
см
куб) 180-200 см куб. стерильного физиологического раствора, затем
со-
держимое тщательно встряхивают до получения гомогенной массы.
4.6.3. Агар типа
Байрд-Паркер.
30 г сухого питательного агара на основе ферментативного гидроли-
зата кормовых дрожжей Дагестанского НПО "Питательные среды"
размешива-
ют в 1 дм куб. дистиллированной воды, добавляют 10 г пирувата натрия,
5 г хлористого лития, тщательно перемешивают и кипятят в течение 1
мин
до полного растворения ингредиентов. Устанавливают рН 7,2. Разливают
во флаконы объемами 100-200-300 см куб в зависимости от потребности
и
стерилизуют при 121гр.С 15 мин. Среда может храниться в течение месяца
в условиях холодильника. Перед употреблением в растопленную и охлажден-
ную до 15-50гр.С среду с соблюдением правил асептики прибавляют (из
рас-
чета на 100 см куб среды) 0,5см куб 2% раствора талиурита калия и 5
см
куб эмульсии яичного желтка. Среду тщательно перемешивают и разливают
в чашки Петри в объеме на 20 см куб на чашку. Чашки со средой могут
быть использованы в течение 24 ч, максимум 48 ч. Перед посевом чашки
со средой подсушивают в термостате общепринятым способом.
4.6.4. Цитратная
плазма кролика.
Цитратная плазма кролика для реакции плазмокоагуляция выпускается
в сухом виде. Готовит непосредственно перед употреблением согласно
прописи в прилагаемом наставлении.
4.7.
Среды для определения спор клостридий, спор аэробных и фа-
культативно-анаэробных микроорганизмов.
4.7.1. Среда Китт-Тароцци
по п. 4.4.1.
4.7.2. Среда Китт-Тароцци с углекислым кальцием, дрожжевым экс-
трактом и аскорбиновой кислотой.
Готовят среду Китт-Тароцци с углекислым кальцием, но в мясо-пеп-
тонный бульон перед фасовкой вносят 2 г сухого дрожжевого экстракта
или 10 см куб. жидкого дрожжевого экстракта. Перед анализом в регене-
рированную среду Китт-Тароцци с углекислым кальцием и дрожжевым экс-
трактом асептически вносят аскорбиновую кислоту из расчета 100 мкг
на
1000 см куб. среды.
4.7.2.1. Среда Китт-Тароцци с углекислым кальцием.
В пробирку или флаконы, предназначенные для среды Тароцци, добав-
ляют на дно щепотку углекислого кальция, стерилизуют горячим воздухом
по ГОСТ 26668-85, закладывают в них кусочки мяса или печени и заливают
мясо-пептонным бульоном с глюкозой, приготавливая среду далее
как
просто Китт-Тароцци.
4.7.3.
Мясо-пептонный агар (бульон) с глюкозой по п. 4.1.2.
4.7.4. Бульон (агар) картофельно-пептонный
картофель - 200 г
пептон - 5 г
хлорид натрия - 5 г
агар (если необходимо) - 15-20 г
200 г очищенного и нарезанного кусочками картофеля заливают 1 дм куб.
водопроводной воды, кипятят 15-20 мин, не допуская разваривания
кусочков, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доводят объем филь-
трата до первоначального. В фильтрате растворяют 5 г пептона, 5 г хло-
рида натрия и расплавляют при нагревании 15-20 г агара. Устанавливают
рН 7,1+0,1. Разливают в колбы и пробирки и стерилизуют при температуре
(125+1)гр С в течение 30 мин.
Рекомендуется контролировать стерильность среды, термостатируя
ее
при (59+1)гр.С 48 ч.
4.7.5. Печеночно-глицериновая
среда.
К 1 дм куб печеночного бульона добавляют 5 г глицерина, 5 г глю-
козы, разливают в пробирки или флаконы с кусочками печени (20-30 г
пе-
чени на 100 см куб среды), устанавливают рН (7,0+0,1) и стерилизуют
при температуре (121+1)гр.С в течение 20 мин.
.gif)
.gif)