МИНИСТЕРСТВО                                                                                                                   УТВЕРЖДАЮ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
    И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                                                                                                     Заместитель руководителя
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                                                                                              Департамента ветеринарии
     (Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                                                                                                           В.В. Селиверстов
 

02.02.99 г. № 13-4-2-/1487

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по проведению гематологического обследования рыб

1. Общие положения

Необходимым условием успешного ведения интенсивного рыбоводства и воспроизводства ценных видов рыб является тщательный контроль за физиологическим состоянием объектов выращивания. Кровь, как наиболее лабильная ткань, быстро реагирует на действие различных факторов и приводит к восстановлению равновесия между организмом и средой. Поэтому для ранней диагностики заболевании, в том числе и незаразных, наряду с паразитологическими, микробиологическими и вирусологическими исследованиями важное значение имеет анализ крови.

В рыбоводстве при гематологическом исследовании принято определять следующие показатели крови:
- количество гемоглобина,
- величину гематокритного числа,
- содержание общего белка в сыворотке крови,
- число эритроцитов,
- содержание гемоглобина в одном эритроците,
- средний объем эритроцитов,
- скорость оседания эритроцитов,
- число лейкоцитов,
- лейкоцитарную формулу,
- количество метгемоглобина.
В приложении приведена таблица, содержащая показатели крови здоровых рыб, и рисунки форменных элементов крови.

2. Взятие крови

2.1. Оборудование и реактивы:
- шприц с инъекционными иглами - стерильные,
- пастеровские пипетки - стерильные,
- часовое стекло,
-5 % раствор натрия цитрата или 0,2 % раствор гепарина (1.000 ЕД/мл),
- анестстики,
- спирт,
- мардя, вата.

2.2. Материал для исследования, ход работы Кровь берут у голодной рыбы, выдержанной в хорошо аэрированной воде в течение 5-10 минут после отлова. Если это невозможно, то пойманную рыбу следует сразу помещать в ведро с водой из водоема в соотношении 1:10, содержащей релаксирующую концентрацию одного из ансстетиков: пропаксат (0,6 - 0,8 мг/л), хиналдин (25 - 30 мг/л), серный эфир (1-1,5 %) и др. Вода, в которой находится анестезированная рыба, должна постоянно аэрироваться.

В зависимости от размера объекта и необходимого количества крови кровь берут несколькими способами: из сердца, жаберной вены, хвостовой артерии, отсечением хвоста.

Место пункции после снятия чешуи обрабатывают 70° спиртом и высушивают ватньм тампоном для удаления слизи. Для взятия крови чаще используют шприц с инъекционной иглой либо пастеровскую пипетку. Инструменты предварительно обрабатывают водным раствором антикоагулянтов: цитрата натрия или гепарина. Место взятия крови нельзя сжимать во избежание попадания тканевой жидкости, искажающей результаты. Повторно брать кровь из одного и того же места не рекомендуется. Анализируемая кровь должна быть свежей, жидкой. Во избежание разрушения эритроцитов (гемолиза) кровь берут в подготовленные пробирки (или часовое стекло), сливая осторожно по стенке.

3. Приготовление и окраска мазков крови

По окрашенным мазкам крови ведут оценку активности эритропоэза и учет лейкоцитов.

3.1. Оборудование и реактивы:
- обезжиренные предметные стекла,
- шлифованное стекло для изготовления мазка,
- краска Май-Грюнвальда,
- рабочий раствор краски азур-эозина (по Романовскому),
- дистиллированная вода с рН 6,8 - 7,1, нейтрализованная фосфатными буферами.

3.2. Подготовка к исследованию

3.2.1. Подготовка предметных стекол.

- один конец стекла размером в 1-1,5 см шлифуют на наждаке для надписи простым карандашом,
- стекла кипятят в 1 %-ном растворе двууглекислой соды - 10 мин,
- охлаждают и промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой - 5 мин.,
- стекла помещают в слегка подкисленный соляной кислотой раствор дистиллированной воды на 2-3 мин; затем дважды промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в сушильном шкафу и хранят в смеси спирта с эфиром 1:1. Перед употреблением их вынимают, насухо вытирают чистой салфеткой или фильтровальной бумагой. Они готовы к использованию.

3.2.2. Приготовление рабочего раствора краски азур - эозина:

- 5,5 мл концентрированной краски азур - эозина помещают в 250 мл нейтральной дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

3.3. Ход работы.

Кровь после взятия (см. п. 2.) наносят в виде небольшой капли на заранее приготовленное обезжиренное предметное стекло, на расстоянии 1,5-2 см от его шлифованного края. Большим и указательным пальцами правой руки берут шлифованное стекло за боковые ребра, ставят на предметное стекло под углом 45° и подвигают тыльной стороной к капле, которая от соприкосновения растекается. Скользящим движением продвигают шлифованное стекло вперед. Кровь должна равномерно распределяться по предметному стеклу в виде мазка. От каждой рыбы готовят не менее двух мазков. После приготовления мазка его высушивают на воздухе в течение 10-15 минут.

Подсохшие мазки без фиксации окрашивают по Паппснгсйму (Романовскому - Гимза). Первый этап - окрашивание и фиксация одновременно раствором Май-Грюнвальда в течение 5 минут, затем промывают нейтральной дистиллированной водой. Второй этап - докрашивание в рабочем растворе Романовского 30-40 минут. Качество окраски клеток контролируют под малым увеличением микроскопа. Окрашенные мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе.

4. Определение содержания гемоглобина

Гемоглобин - это дыхательный пигмент, содержащийся в эритроцитах. Его количество в организме выражается в г/л и имеет важное диагностическое значение. Определять содержание гемоглобина можно двумя способами: по Сали и цианметгемоглобиновым методом. Наиболее распространенным и простым является метод определения гемоглобина по Сали. Однако он дает ряд объективных (постепенное усиление окраски) и субъективных (визуальное сравнение цвета) ошибок. Цианметге-моглобиновьга метод является наиболее точным.

4.1. Метод определения гемоглобина по Сали . 4.1.1.

Подготовка к исследованию

Приготовление 0,1 н. раствора соляной кислоты:
- на 1 л дистиллированной воды добавляют химически чистой 8,2 см³ соляной кислоты с удельным весом 1,19, либо 0,1 н. фиксанал соляной кислоты.

4.1.2. Оборудование и реактивы

- гемометр Сали,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- глазная пипетка,
- стеклянная палочка,
- часовое стекло,
- 0,1 н. раствор соляной кислоты,
- дистиллированная вода.

4.1.3. Ход определения и учет результатов В градуированную пипетку гемометра Сали до метки "2" глазной пипеткой наливают децинормальньгй раствор соляной кислоты. В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают ее в раствор соляной кислоты. Полученную смесь перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени в пробирку по каплям доливают дистиллированную воду и, перемешивая стеклянной палочкой, подбирают цвет рабочего раствора до совпадения с цветом жидкости в стандартных пробирках. Количество ге-моглобина отсчитывают по нижнему мениску рабочего раствора на градуированной пробирке (показатели в г % выражают в г/л), 1 г % равен 10 г/л.

4.2. Цианметгемоглобиновый фотометрический метод

4.2.1. Подготовка к исследованию.

Приготовление раствора Драбкина, на 1 л реактива берут:
Бикарбонат натрия - 1 г, красная кровяная соль - 0,2 г, цианистый калий или натрий - 0,05 г, дистиллированная вода -остальной объем.

4.2.2. Оборудование и реактивы:
- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектро4>отометр с зеленым светофильтром и кюветами толщиной 1 см;
- химические пробирки с пробками;
- капиллярная пипетка от гсмометра Сали объемом 20 мкл;
- градуированная пипетка на 5 мл;
- раствор Драбкина.

4 2.3. Ход определения и учет результатов.

Мерной пипеткой в пробирку наливают 5 мл трансформирующего раствора Драбкина. Пипеткой от гемометра Сали добавляют 20 мкл крови. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и оставляют в холодильнике на 20 минут. По истечению этого времени рабочий и трансформирующий растворы наливают в кюветы и, используя зеленый светофильтр, проводят измерения на ФЭКе. Расчет концентрации гемоглобина (г/л) на основе данного определения проводят по формуле:

x=d540 x 367,1 г/л, где:

d 540 - показания ФЭК;
367,1 - коэффициент пересчета, учитывающий разведение крови, миллимолярный вес гемоглобина и другие показатели.

5. Определение гематокритной величины

Гематокритное число - это отношение объема эритроцитов к общему объему крови, выраженное в л/л (1 л/л равен 100 %).

5.1. Подготовка к исследованию.

Приготовление растворов антикоагулянта:
- раствор Геллера и Пауля:
- на 100 мл воды: щавелевокислый аммоний - ],2 г, щавелевокислый калий - 0,8 г;
- 5 % раствор трсхзамсщенного лимоннокислого натрия.

5.2. Оборудование и реактивы:
- микрокапилляры,
- центрифуга, при массовом отборе проб удобнее использовать спе циальную центрифугу МГЦ - 8,
- растворы антикоагулянтов: раствор гепарина 1000 ЕД/мл или 7,7 мг/мл, или раствор Геллера и Пауля, или 5% раствор лимоннокислого натрия.

5.3. Ход определения и учет результатов.

Микрокапилляры предварительно обрабатывают одним из растворов антикоагулянта. Можно несколько раз сполоснуть их раствором гепарина и высушить при комнатной температуре или же в капилляры насасывают на 1/10 часть раствора Геллера и Пауля и высушивают в сушильном шкафу при 60°С. В подготовленные таким образом капилляры набирают кровь. Конец капилляра закупоривают с помощью замазки и ставят центрифугировать до получения постоянного объема эритроцитов. Время цснтри4)угирования зависит от скорости вращения центрифуги. Достигают эффекта полного осаждения эритроцитов. Отсчет объема эритроцитов и плазмы производят при помощи миллиметровой линейки. Процентное отношение столба эритроцитов к высоте всего столба крови является гематокритной величиной, которое переводят в размерность л/л.

6. Определение белка в сыворотке крови

Содержание белка в сыворотке крови рыб служит экспресс - тестом для определения уровня физиологического состояния рыб при выращивании в современных рыбоводных хозяйствах. Концентрацию белка выражают в г % или в г/л; 1 г/л равен 10 г %.

6.1. Оборудование и реактивы:
- уленгутки или небольшие пробирки,
- штатив,
- центрифуга,
- рефрактометр,
- пастеровские пипетки,
- спирт.

6.2. Ход определения и учет результатов

2-3 мл крови, полученной одним из методов (см. п.2.), помещают в подготовленные уленгутки или небольшие пробирки. После этого кровь центрифугируют 5 минут при 3000 об./мин. В случае отсутствия центрифуги проводят отстаивание крови в холодильнике 30 - 45 минут. Полученная после центрифугирования или отстаивания сыворотка отсасывается чистой пастеровской пипеткой и несколько се капель помещают на пластинку рефрактометра. Регистрируют показатель преломления по его шкале. По таблице 1, приведенной ниже, определяют содержаниебелка в сыворотке крови. После каждого исследования обе поверхности призм протирают марлевым тампоном, смоченным в спирте.

7. Определение числа эритроцитов пробирочным методом в камере Горяева
Число эритроцитов (в млн. в 1 мкл) - важный показатель физиологического состояния рыб, который характеризует наличие анемии.

7.1. Подготовка к исследованию.
Приготовление раствора Хендрикса:
- сульфат натрия - 20 г, хлористый натрий - 5 г, цитрат натрия трехзамещенный - 3 г, ледяная уксусная кислота - 100 мл, вода дистиллированная до 1 ()()() мл.

7.2. Оборудование и реактивы;

- химические пробирки с пробками,
- градуированная пипетка на 5 мл,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- пастеровская пипетка,
- камера Горяева,
- микроскоп,
- раствор Хендрикса.

7.3. Ход определения и учет результатов

Градуированной пипеткой в химическую пробирку наливают 4 мл раствора Хендрикса. В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают в пробирку, осторожно промывая капилляр несколько раз. Покровное стекло притирают к камере Горяева до появления ньютоновских колец. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и пастеровской пипеткой заполняют камеру Горяева. Через 1-2 минуты начинают подсчет числа эритроцитов под микроскопом в 5 больших или 80 малых квадратах, расположенных по диагонали. Для определения количества эритроцитов в 1 мкл достаточно умножить полученное при подсчете число эритроцитов на 10000.

8. Определение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ)
Показатель среднего содержания гемоглобина в одном эритроците очень важен для выявления гипо- и гиперхромачии. СГЭ в одном эритроците принято выражать в пикограммах (синоним - микромикрограмм); 1 пг- КГ¹² г.

8.1. Ход определения и учет результатов.

СГЭ в одном эритроците определяют делением концентрации гемоглобина в 1 мкл крови, выраженной в грамм-процентах, на число эритроцитов в этом же объеме. Для упрощения расчетов можно разделить содержание гемоглобина, выраженное в г/л, на число эритроцитов в миллионах.

9. Определение среднего объема эритроцитов

Для выяснения наличия микро- и макроцитозов наряду с непосредственным измерением размеров эритроцитов на мазках удобнее вычислять средний объем эритроцитов косвенно, который выражают в кубических микрометрах (мкм^3).

9.1. Ход определения и учет результатов.
Для определения среднего объема эритроцитов показания гсма-токритного числа делят на число эритроцитов в 1 мкл крови.

Практически средний объем эритроцитов определяют по формуле:

А х 1000/Б, где:

А - гематокритное число, л/л ;
Б - число эритроцитов , млн /мкл .

*при наличии гемолиза необходимо из результатов определения общего содержания белка вычесть эксперименталыю установленную поправку на степень гемолиза: при " l " - 0,6 -0,7; при "++" 1,2 - 1,4; сильногемолиэированная сыворотка для определения общего содержания белка использована быть не может.

10. Определение скорости оседания эритроцитов

В зависимости от физических и химических свойств крови эритроциты оседают в микрокапиллярах с различной скоростью. Скорость оседания эритроцитов определяется в аппаратах Панченкова и выражается в миллиметрах за 1 ч (мм/ч).

10.1. Оборудование и реактивы:

- часовое стекло,
- аппарат Панченкова, состоящий из штатива и специальных капиллярных пипеток, на которых нанесена миллиметровая шкала длиной К) см; верхнее деление шкалы отмечено буквами О и К (кровь), против деления 50 имеется буква Р (реактив),
- профильтрованный 5-% раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия.

10.2. Ход определения и учет результатов.

Промывают капиллярную пипетку раствором лимоннокислого натрия, затем набирают этот раствор до метки Р и выливают его в часовое стекло. Тем же капилляром набирают кровь 2 раза до метки К и спускают в часовое стекло. Хорошо перемешивают и, набрав смесь в капилляр до метки К, ставят в штатив на ! ч. По истечении этого времени определяют скорость оседания эритроцитов. Величину столбика плазмы, освободившегося от эритроцитов, учитывают по делениям на капиллярной пипетке.

При работе с молодью рыб допускается набирать меньший объем крови (1/2 или 1/4 К), при этом соотношение лимоннокислого натрия и крови необходимо строго сохранять на уровне 1:2.