МИНИСТЕРСТВО                                                                                                                   УТВЕРЖДАЮ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
    И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                                                                                                     Заместитель руководителя
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                                                                                              Департамента ветеринарии
     (Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                                                                                                           В.В. Селиверстов
 

02.02.99 г. № 13-4-2-/1487

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по проведению гематологического обследования рыб

1. Общие положения

Необходимым условием успешного ведения интенсивного рыбоводства и воспроизводства ценных видов рыб является тщательный контроль за физиологическим состоянием объектов выращивания. Кровь, как наиболее лабильная ткань, быстро реагирует на действие различных факторов и приводит к восстановлению равновесия между организмом и средой. Поэтому для ранней диагностики заболевании, в том числе и незаразных, наряду с паразитологическими, микробиологическими и вирусологическими исследованиями важное значение имеет анализ крови.

В рыбоводстве при гематологическом исследовании принято определять следующие показатели крови:
- количество гемоглобина,
- величину гематокритного числа,
- содержание общего белка в сыворотке крови,
- число эритроцитов,
- содержание гемоглобина в одном эритроците,
- средний объем эритроцитов,
- скорость оседания эритроцитов,
- число лейкоцитов,
- лейкоцитарную формулу,
- количество метгемоглобина.
В приложении приведена таблица, содержащая показатели крови здоровых рыб, и рисунки форменных элементов крови.

2. Взятие крови

2.1. Оборудование и реактивы:
- шприц с инъекционными иглами - стерильные,
- пастеровские пипетки - стерильные,
- часовое стекло,
-5 % раствор натрия цитрата или 0,2 % раствор гепарина (1.000 ЕД/мл),
- анестстики,
- спирт,
- мардя, вата.

2.2. Материал для исследования, ход работы Кровь берут у голодной рыбы, выдержанной в хорошо аэрированной воде в течение 5-10 минут после отлова. Если это невозможно, то пойманную рыбу следует сразу помещать в ведро с водой из водоема в соотношении 1:10, содержащей релаксирующую концентрацию одного из ансстетиков: пропаксат (0,6 - 0,8 мг/л), хиналдин (25 - 30 мг/л), серный эфир (1-1,5 %) и др. Вода, в которой находится анестезированная рыба, должна постоянно аэрироваться.

В зависимости от размера объекта и необходимого количества крови кровь берут несколькими способами: из сердца, жаберной вены, хвостовой артерии, отсечением хвоста.

Место пункции после снятия чешуи обрабатывают 70° спиртом и высушивают ватньм тампоном для удаления слизи. Для взятия крови чаще используют шприц с инъекционной иглой либо пастеровскую пипетку. Инструменты предварительно обрабатывают водным раствором антикоагулянтов: цитрата натрия или гепарина. Место взятия крови нельзя сжимать во избежание попадания тканевой жидкости, искажающей результаты. Повторно брать кровь из одного и того же места не рекомендуется. Анализируемая кровь должна быть свежей, жидкой. Во избежание разрушения эритроцитов (гемолиза) кровь берут в подготовленные пробирки (или часовое стекло), сливая осторожно по стенке.

3. Приготовление и окраска мазков крови

По окрашенным мазкам крови ведут оценку активности эритропоэза и учет лейкоцитов.

3.1. Оборудование и реактивы:
- обезжиренные предметные стекла,
- шлифованное стекло для изготовления мазка,
- краска Май-Грюнвальда,
- рабочий раствор краски азур-эозина (по Романовскому),
- дистиллированная вода с рН 6,8 - 7,1, нейтрализованная фосфатными буферами.

3.2. Подготовка к исследованию

3.2.1. Подготовка предметных стекол.

- один конец стекла размером в 1-1,5 см шлифуют на наждаке для надписи простым карандашом,
- стекла кипятят в 1 %-ном растворе двууглекислой соды - 10 мин,
- охлаждают и промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой - 5 мин.,
- стекла помещают в слегка подкисленный соляной кислотой раствор дистиллированной воды на 2-3 мин; затем дважды промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в сушильном шкафу и хранят в смеси спирта с эфиром 1:1. Перед употреблением их вынимают, насухо вытирают чистой салфеткой или фильтровальной бумагой. Они готовы к использованию.

3.2.2. Приготовление рабочего раствора краски азур - эозина:

- 5,5 мл концентрированной краски азур - эозина помещают в 250 мл нейтральной дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

3.3. Ход работы.

Кровь после взятия (см. п. 2.) наносят в виде небольшой капли на заранее приготовленное обезжиренное предметное стекло, на расстоянии 1,5-2 см от его шлифованного края. Большим и указательным пальцами правой руки берут шлифованное стекло за боковые ребра, ставят на предметное стекло под углом 45° и подвигают тыльной стороной к капле, которая от соприкосновения растекается. Скользящим движением продвигают шлифованное стекло вперед. Кровь должна равномерно распределяться по предметному стеклу в виде мазка. От каждой рыбы готовят не менее двух мазков. После приготовления мазка его высушивают на воздухе в течение 10-15 минут.

Подсохшие мазки без фиксации окрашивают по Паппснгсйму (Романовскому - Гимза). Первый этап - окрашивание и фиксация одновременно раствором Май-Грюнвальда в течение 5 минут, затем промывают нейтральной дистиллированной водой. Второй этап - докрашивание в рабочем растворе Романовского 30-40 минут. Качество окраски клеток контролируют под малым увеличением микроскопа. Окрашенные мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе.

4. Определение содержания гемоглобина

Гемоглобин - это дыхательный пигмент, содержащийся в эритроцитах. Его количество в организме выражается в г/л и имеет важное диагностическое значение. Определять содержание гемоглобина можно двумя способами: по Сали и цианметгемоглобиновым методом. Наиболее распространенным и простым является метод определения гемоглобина по Сали. Однако он дает ряд объективных (постепенное усиление окраски) и субъективных (визуальное сравнение цвета) ошибок. Цианметге-моглобиновьга метод является наиболее точным.

4.1. Метод определения гемоглобина по Сали . 4.1.1.

Подготовка к исследованию

Приготовление 0,1 н. раствора соляной кислоты:
- на 1 л дистиллированной воды добавляют химически чистой 8,2 см3 соляной кислоты с удельным весом 1,19, либо 0,1 н. фиксанал соляной кислоты.

4.1.2. Оборудование и реактивы

- гемометр Сали,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- глазная пипетка,
- стеклянная палочка,
- часовое стекло,
- 0,1 н. раствор соляной кислоты,
- дистиллированная вода.

4.1.3. Ход определения и учет результатов В градуированную пипетку гемометра Сали до метки "2" глазной пипеткой наливают децинормальньгй раствор соляной кислоты. В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают ее в раствор соляной кислоты. Полученную смесь перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени в пробирку по каплям доливают дистиллированную воду и, перемешивая стеклянной палочкой, подбирают цвет рабочего раствора до совпадения с цветом жидкости в стандартных пробирках. Количество ге-моглобина отсчитывают по нижнему мениску рабочего раствора на градуированной пробирке (показатели в г % выражают в г/л), 1 г % равен 10 г/л.

4.2. Цианметгемоглобиновый фотометрический метод

4.2.1. Подготовка к исследованию.

Приготовление раствора Драбкина, на 1 л реактива берут:
Бикарбонат натрия - 1 г, красная кровяная соль - 0,2 г, цианистый калий или натрий - 0,05 г, дистиллированная вода -остальной объем.

4.2.2. Оборудование и реактивы:
- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектро4>отометр с зеленым светофильтром и кюветами толщиной 1 см;
- химические пробирки с пробками;
- капиллярная пипетка от гсмометра Сали объемом 20 мкл;
- градуированная пипетка на 5 мл;
- раствор Драбкина.

4 2.3. Ход определения и учет результатов.

Мерной пипеткой в пробирку наливают 5 мл трансформирующего раствора Драбкина. Пипеткой от гемометра Сали добавляют 20 мкл крови. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и оставляют в холодильнике на 20 минут. По истечению этого времени рабочий и трансформирующий растворы наливают в кюветы и, используя зеленый светофильтр, проводят измерения на ФЭКе. Расчет концентрации гемоглобина (г/л) на основе данного определения проводят по формуле:

x=d540 x 367,1 г/л, где:

d 540 - показания ФЭК;
367,1 - коэффициент пересчета, учитывающий разведение крови, миллимолярный вес гемоглобина и другие показатели.

5. Определение гематокритной величины

Гематокритное число - это отношение объема эритроцитов к общему объему крови, выраженное в л/л (1 л/л равен 100 %).

5.1. Подготовка к исследованию.

Приготовление растворов антикоагулянта:
- раствор Геллера и Пауля:
- на 100 мл воды: щавелевокислый аммоний - ],2 г, щавелевокислый калий - 0,8 г;
- 5 % раствор трсхзамсщенного лимоннокислого натрия.

5.2. Оборудование и реактивы:
- микрокапилляры,
- центрифуга, при массовом отборе проб удобнее использовать спе циальную центрифугу МГЦ - 8,
- растворы антикоагулянтов: раствор гепарина 1000 ЕД/мл или 7,7 мг/мл, или раствор Геллера и Пауля, или 5% раствор лимоннокислого натрия.

5.3. Ход определения и учет результатов.

Микрокапилляры предварительно обрабатывают одним из растворов антикоагулянта. Можно несколько раз сполоснуть их раствором гепарина и высушить при комнатной температуре или же в капилляры насасывают на 1/10 часть раствора Геллера и Пауля и высушивают в сушильном шкафу при 60°С. В подготовленные таким образом капилляры набирают кровь. Конец капилляра закупоривают с помощью замазки и ставят центрифугировать до получения постоянного объема эритроцитов. Время цснтри4)угирования зависит от скорости вращения центрифуги. Достигают эффекта полного осаждения эритроцитов. Отсчет объема эритроцитов и плазмы производят при помощи миллиметровой линейки. Процентное отношение столба эритроцитов к высоте всего столба крови является гематокритной величиной, которое переводят в размерность л/л.

6. Определение белка в сыворотке крови

Содержание белка в сыворотке крови рыб служит экспресс - тестом для определения уровня физиологического состояния рыб при выращивании в современных рыбоводных хозяйствах. Концентрацию белка выражают в г % или в г/л; 1 г/л равен 10 г %.

6.1. Оборудование и реактивы:
- уленгутки или небольшие пробирки,
- штатив,
- центрифуга,
- рефрактометр,
- пастеровские пипетки,
- спирт.

6.2. Ход определения и учет результатов

2-3 мл крови, полученной одним из методов (см. п.2.), помещают в подготовленные уленгутки или небольшие пробирки. После этого кровь центрифугируют 5 минут при 3000 об./мин. В случае отсутствия центрифуги проводят отстаивание крови в холодильнике 30 - 45 минут. Полученная после центрифугирования или отстаивания сыворотка отсасывается чистой пастеровской пипеткой и несколько се капель помещают на пластинку рефрактометра. Регистрируют показатель преломления по его шкале. По таблице 1, приведенной ниже, определяют содержаниебелка в сыворотке крови. После каждого исследования обе поверхности призм протирают марлевым тампоном, смоченным в спирте.

7. Определение числа эритроцитов пробирочным методом в камере Горяева
Число эритроцитов (в млн. в 1 мкл) - важный показатель физиологического состояния рыб, который характеризует наличие анемии.

7.1. Подготовка к исследованию.
Приготовление раствора Хендрикса:
- сульфат натрия - 20 г, хлористый натрий - 5 г, цитрат натрия трехзамещенный - 3 г, ледяная уксусная кислота - 100 мл, вода дистиллированная до 1 ()()() мл.

7.2. Оборудование и реактивы;

- химические пробирки с пробками,
- градуированная пипетка на 5 мл,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- пастеровская пипетка,
- камера Горяева,
- микроскоп,
- раствор Хендрикса.

7.3. Ход определения и учет результатов

Градуированной пипеткой в химическую пробирку наливают 4 мл раствора Хендрикса. В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают в пробирку, осторожно промывая капилляр несколько раз. Покровное стекло притирают к камере Горяева до появления ньютоновских колец. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и пастеровской пипеткой заполняют камеру Горяева. Через 1-2 минуты начинают подсчет числа эритроцитов под микроскопом в 5 больших или 80 малых квадратах, расположенных по диагонали. Для определения количества эритроцитов в 1 мкл достаточно умножить полученное при подсчете число эритроцитов на 10000.

Таблица i
Концентрация белка (в г %) при различном показателе преломления*
Концентрация белка (в г %)
Показа-

тель преломления

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1,337 0,60 0,66 0,72 0,77 0,83 0,89 0,95 1,01 1,07 1.12
1,338 1,18 1,24 1,30 1,36 1,41 1,47 1,53 1,59 1,65 1,70
1,339 1,76 1,82 1,88 1,94 2,00 2,05 2,11 2,17 2,23 2,29
1,340 2,34 2,40 2,46 2,52 2,58 2,63 2,69 2,75 2,81 2,87
1,341 2,93 2,98 3,04 3,10 3,16 3,22 3,27 3,33 3,39 3.46
1,342 3,51 3,57 3,62 3,68 3,74 3,80 3,86 3,91 3,97 4,03
1,343 4,09 4,15 4,20 4,26 4,32 4,38 4,44 4,50 4,55 4,61
1,344 4,67 4,73 4,79 4,84 4,90 4,96 5,02 5,08 5,13 5,19
1,345 5,25 5,31 5,37 5,43 5,48 5,54 5,60 5,66 5,72 5,77
1,346 5,83 5,89 5,95 6,01 6,07 6,12 6,18 6,24 6,30 6,36
1,347 6,41 6,47 6,53 6,59 6,65 6,70 6,76 6,82 6,88 6,94
1,348 7,00 7,05 7,1) 7,17 7,23 7,29 7,34 7,40 7,46 7,52
1.349 7.58 7,63 7,69 7,75 7,81 7,87 7.93 7,98 8,04 8,10
1,350 8,16 8,22 8,27 8,33 8,39 8,46 8,51 8,57 8,62 8,68
1,351 8.74 8,80 8,86 8,91 8.97 9,03 9,09 9,15 9,20 9,26
1,352 9,32 9,38 9,44 9,50 9,55 9,61 9,67 9,73 9,79 9,84
1,353 9,90 9,96 10,02 10,08 10,13 10,19 10,25 10,31 10,37 10,4

 
 

8. Определение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ)
Показатель среднего содержания гемоглобина в одном эритроците очень важен для выявления гипо- и гиперхромачии. СГЭ в одном эритроците принято выражать в пикограммах (синоним - микромикрограмм); 1 пг- КГ12 г.

8.1. Ход определения и учет результатов.

СГЭ в одном эритроците определяют делением концентрации гемоглобина в 1 мкл крови, выраженной в грамм-процентах, на число эритроцитов в этом же объеме. Для упрощения расчетов можно разделить содержание гемоглобина, выраженное в г/л, на число эритроцитов в миллионах.

9. Определение среднего объема эритроцитов

Для выяснения наличия микро- и макроцитозов наряду с непосредственным измерением размеров эритроцитов на мазках удобнее вычислять средний объем эритроцитов косвенно, который выражают в кубических микрометрах (мкм3).

9.1. Ход определения и учет результатов.
Для определения среднего объема эритроцитов показания гсма-токритного числа делят на число эритроцитов в 1 мкл крови.

Практически средний объем эритроцитов определяют по формуле:

А х 1000/Б, где:

А - гематокритное число, л/л ;
Б - число эритроцитов , млн /мкл .

*при наличии гемолиза необходимо из результатов определения общего содержания белка вычесть эксперименталыю установленную поправку на степень гемолиза: при " l " - 0,6 -0,7; при "++" 1,2 - 1,4; сильногемолиэированная сыворотка для определения общего содержания белка использована быть не может.

10. Определение скорости оседания эритроцитов

В зависимости от физических и химических свойств крови эритроциты оседают в микрокапиллярах с различной скоростью. Скорость оседания эритроцитов определяется в аппаратах Панченкова и выражается в миллиметрах за 1 ч (мм/ч).

10.1. Оборудование и реактивы:

- часовое стекло,
- аппарат Панченкова, состоящий из штатива и специальных капиллярных пипеток, на которых нанесена миллиметровая шкала длиной К) см; верхнее деление шкалы отмечено буквами О и К (кровь), против деления 50 имеется буква Р (реактив),
- профильтрованный 5-% раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия.

10.2. Ход определения и учет результатов.

Промывают капиллярную пипетку раствором лимоннокислого натрия, затем набирают этот раствор до метки Р и выливают его в часовое стекло. Тем же капилляром набирают кровь 2 раза до метки К и спускают в часовое стекло. Хорошо перемешивают и, набрав смесь в капилляр до метки К, ставят в штатив на ! ч. По истечении этого времени определяют скорость оседания эритроцитов. Величину столбика плазмы, освободившегося от эритроцитов, учитывают по делениям на капиллярной пипетке.

При работе с молодью рыб допускается набирать меньший объем крови (1/2 или 1/4 К), при этом соотношение лимоннокислого натрия и крови необходимо строго сохранять на уровне 1:2.