МИНИСТЕРСТВО
  СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                                         УТВЕРЖДАЮ
(Минсельхозпрод России)                                       Заместитель начальника
                                                                                     Департамента ветеринарии
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                                            В.В.Селиверстов

22.09.98г.  №13-4-2/1404

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по определению возбудителей
диплостомозов пресноводных рыб

1. Общие положения
1.1. В фауне России и сопредельных государств выявлено 17
видов рода метацеркарий трематод рода diplostomum (отряд
strigeidida, семейство diplostomidae), каждый из которых
вызывает самостоятельную форму заболеваний. Для их
обозначения к названию «диплостомоз» добавляется
соответствующая данному виду возбудителя литера латинского
алфавита (Приложение 1.).

1.2. Видовая принадлежность возбудителей и
вызываемых ими форм диплостомозов определяется по
инвазионным метацеркариям и при строгом соблюдении
описанной ниже методики сбора и фиксации,
приготовления постоянных препаратов и
морфометрического анализа, а также с учетом
гостальной специфичности (приуроченности к
определенной более или менее узкой группе хозяев)
метацеркарий, а также их строгой приуроченности к
обитанию в определенных органах рыбы (глаза, головной
мозг) или отдельных составных частей глаза
(хрусталик, стекловидное тело, внутренние оболочки и
жидкие среды глаза).

2. Исследование рыб
2.1. Для исследования берут 10-15 экземпляров свежеуснувших
рыб обследуемого вида и составляют протокол их исследования,
в котором регистрируется дата исследования, вид рыбы и место
ее вылова.

2.2. Каждую рыбу взвешивают, измеряют длину от
вершины рыла до основания лучей хвостового плавника,
проводят визуальный осмотр рыбы с обращением особого
внимания на наличие патологических изменении глаз
(изменение формы и размеров зрачка, патология
глазного яблока), а также точечных кровоизлияний на
жаберных крышках и в основании плавников. Выявленные
патологии описывают и заносят в протокол обследования
рыб.

2.3. На наличие метацеркарий рода diplostomum
обследуют глаза и головной мозг рыб и круглоротых.

2.4. Глаза извлекают из орбит и вскрывают с
помощью ножниц или препаровальных игл на часовом
стекле или чашке Петри в тонком слое воды. Хрусталики
и стекловидное тело глаза переносят на отдельные
часовые стекла с речной водой, а с внутренних стенок
глазного яблока делают соскоб пинцетом.

2.4.1. Хрусталики и стекловидное тело сразу же
(пока они не потеряли своей прозрачности)
просматривают под бинокуляром, а при наличии в них
паразитов разрывают препаровальными иглами на мелкие
части и на 0,5 - 1,0 час оставляют в воде. За это
время находящиеся в тканях этих органов метацеркарии
сами выйдут в воду и могут быть собраны тонко
оттянутой пипеткой. Молодые, еще неинвазионные
метацеркарии при этом успевают погибнуть, а инва-
зионные сохранятся в живом виде.

2.4.2. Соскоб с внутренних стенок глаза обследуют
компрессорно под бинокуляром. Обнаруженных метацеркарий
аккуратно извлекают из содержимого глазного яблока,
отмывают в пресной воде. Если метацеркарий в содержимом
глазного яблока очень много (десятки и сотни), отмывку их
удобнее производить в 0,2л стаканчике методом отмучивания
и последовательных сливов.

2.5. Головной мозг извлекают пинцетом из черепной
коробки через вскрытую крышу черепа, помещают на
часовое стекло с водой и обследуют визуально на
наличие кровоизлияний на сосудистой оболочке мозга и
в мозговой ткани. Для выявления метацеркарий рода
diplostomum головной мозг исследуют под бинокулярным
микроскопом компрессорным способом, либо - если
метацеркарий очень много, - методом отмучивания и
последовательных сливов.

2.6. Собранных метацеркарий подсчитывают (отдельно
инвазионных и неинвазионных), отмывают водой, а
перед фиксацией изучают прижизненно.

3. Изучение живых метацеркарий
3.1. По живым метацеркариям уточняют их
принадлежность к роду diplostomum и выявляют
некоторые специфические особенности их морфологии.
Для этого собранных метацеркарий помещают на
предметное стекло с лупкой и исследуют их под малым
увеличением микроскопа, обращая основное внимание на
форму, количество и характер расположения известковых
телец в теле метацеркарий.

3.2. По форме и размерам известковых телец
дифференцируют метацеркарий рода diplostomum от
таковых рода tylodelphys: у первых известковые тельца
имеют шаровидную форму и разные размеры, у вторых они
овальные и практически одинаковые по размерам.

3.3. Количество и характер расположения
известковых телец в теле метацеркарий рода
diplostomum   один из важных морфологических
критериев вида метацеркарий (Рис. 1.). Отмечают, к
каким из изображенных на указанном рисунке видам
обнаруженные метацеркарий наиболее близки по числу
известковых телец и характеру их расположения. В
глазах одной и той же особи рыбы могут одновременно
паразитировать несколько видов рода diplostomum.

3.4. Отсутствие известковых телец в теле
метацеркарий рода diplostomum свидетельствует о том,
что эти метацеркарий либо еще молодые н не достигли
инвазионной стадии развития (чаще встречаются у
молоди рыб), либо уже старые, утратившие свою инвази-
онность особи (чаще обнаруживаются у рыб старше пяти
лет).

4. Фиксация и окраска метацеркарий,
приготовление постоянных препаратов

4.1. Фиксацию и окраску метацеркарий проводят
уксуснокислым кармином путем добавления краски к
живым метацеркариям в минимальном количестве воды.
Делать это удобнее всего в биологической пробирке
объемом не более 4-5 мл. Соотношение объема краски и
воды в пробирке должно быть не менее 10:1. Все после-
дующие манипуляции по подготовке метацеркарий для
монтажа в постоянном препарате осуществляют в той же
пробирке путем последовательной смены в ней реактивов
тонко оттянутой пипеткой.

4.2. Через 15-20 минут краску слить и заменить на
5-10 минут таким же объемом 1% раствора соляной
кислоты в 70° этиловом спирте (дифференцировка
окраски).

4.3. Обезвоживание окрашенных метацеркарий производят
спиртами  возрастающей  крепости  (85° и  двойная
смена 96° этилового спирта),просветлении - диметилфталатом
(диметиловый эфир фталевой кислоты). Диметилфталат
вносят в пробирку специальной «диметилфталатовой»
пипеткой, медленно выпуская его по стенке пробирки,
непосредственно в спирт. Метацеркарии при этом
оказываются на границе более легкого спирта и
диметилфталата. Просветление считается законченным,
когда метацеркарии опустятся на дно пробирки. После
этого поверхностные слои спирта и смеси спирта с
диметилфталатом удаляют и заменяют чистым
диметилфталатом.

4.4. Монтаж препарата производят на предметном
стекле. Для этого в центр предметного стекла помещают
каплю диметилфталата с метацеркариями, излишки
диметилфталата насколько возможно удаляют и наносят
каплю жидкого бальзама, расправляют ее препа-
ровальной иглой, а метацеркарий равномерно (лучше
рядами) размещают на стекле. Через 1-3 часа, когда
препарат слегка подсохнет, на него наносят одну-две
капли жидкого бальзама и накрывают покровным стеклом.
Препарат этикетируют и хранят в течение первого года
(пока не высохнут) на лежачих лоточках.

4.5. Если нет возможности завершить процесс
изготовления препарата сразу, то его можно прервать
на неограниченно долгое время на двух этапах: после
дифференцировки окраски, поместив метацеркарий в
пробирку с 70° спиртом, или оставить метацеркарий в
пробирке с диметилфталатом.

4.6. Приготовление уксуснокислого кармина: в
100мл 45%-ной уксусной кислоты растворить (на водяной
бане!) 3-4 г мелко растертого порошка кармина;
остывший раствор отфильтровать и разбавить 45%-ной
уксусной кислотой в соотношении 1:1. Хранить в плотно
закрытой стеклянной посуде.

5. Определение родовой н видовой принадлежности
возбудителей диплостомозов пресноводных рыб.

5.1. В отличие от большинства метацеркарий
трематод, встречающихся в глазах и головном мозге рыб
и круглоротых, метацеркарий рода diplostomun ведут
активный (подвижный) образ жизни, никогда не образуя
вокруг себя ни цист, ни капсул. В этом отношении они
близки только к метацеркариям рода tyiodclphys, от
которых, как уже отмечалось, четко отличаются формой
и размерами известковых телец (см. п. 3.2.).

5.2. Для видовой диагностики возбудителей диплостомозов
рыб используют помимо уже отмеченных выше биологических
(гостальная специфичность и приуроченность к обитанию и
строго определенных органах рыбы) и морфологических
(число известковых телец) признаков целый ряд морфомет-
рических критериев вида, а именно: длину (А в мкм),
ширину (В в мкм) и произведение длины на ширину (А В)
тела, роговой и брюшной присосок, органа Брандсса;
расстояние от переднего конца тела до центра брюшной
присоски (О в мкм); отношения АВ тела к А В органа
Брандеса и к АВ брюшной присоски; АВ органа Брандеса
и АВ ротовой присоски к А В брюшной присоски;
выраженное в процентах отношение В и О к А тела (Рис.
2).

5.3. Определение видовой принадлежности
метацеркарий проводят по определительной таблице
(Приложение 2).

6. Меры безопасности и личной гигиены
6.1. Лица, проводящие исследования рыб на их
зараженность возбудителями диплостомозов, сбор,
фиксацию и окраску метацеркарий, а также
приготовление реактивов и постоянных препаратов из
метацеркарий, должны работать в халатах и соблюдать
правила работы с ядовитыми (ледяная уксусная кислота)
и огнеопасными (этиловый спирт, диметиловый эфир
фталевой кислоты) веществами.

6.2. Приготовление (варка) уксуснокислого кармина
должно производиться в вытяжном шкафу и только на
водяной бане.

6.3. После окончания работы вымыть руки и лицо
теплой водой с мылом, а место работы обработать 2%-
ным раствором кальцинированной соды.

 
 
 

Рис. 1. Число и расположение известковых телец у метацеркарий некоторых
видов рода diplostomum: а - d. rutili; б - d. chromatophorum; в - d. helveticum; г - d.
volvens; д - d. phoxini; e - d.mergi; ж - d. pungitii (по Шигину, 1986)

Рис. 2. Схема измерений метацеркрий рода diplostomum.
Обозначения: am - длина тела; Вm - ширина тела; Арп -
длина ротовой присоски; Врп - ширина ротовой
присоски; Абп -длина брюшной присоски: Вбп - ширина
брюшной присоски; Аоб -длина органа Брандеса; Воб -
ширина органа Брандеса; Аф - длина фаринкса; Вф -
ширина фаринкса; aз.с. - длина заднего сегмента: 0 -
расстояние от переднего конца тела до центра брюшной
присоски (по Шигину,1986).