Методические указания

    МИНИСТЕРСТВО        
  СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА                          Утверждаю
   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                         Зам. руководителя
 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                       Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)                     В.В.Селиверстов

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

11.10.99г.  № 13-7-2/1758

Методические указания 
по ускоренной индикации морганелл, 
сальмонелл и энтеропатогенных эшерихий 
с адгезивными антигенами в 
патологическом материале, кормах, 
объектах внешней среды в реакции 
коагглютинации

1. Общие положения
1.1 .Настоящие  методические  указания   предназначены  для ускоренной 
индикации бактерий родов salmonella и morganella, а также энтеропатогенных 
эшерихий с адгезивными антигенами К88, К99, 987Р, f41, f18, А20 в 
патологическом материале от больных и павших животных, кормах, объектах 
внешней среды, а также для серогрупповой идентификации культур указанных 
бактерий, выделенных из разных источников, в реакции коагглютинации.

1.2. Реакция коагглютинации (РКОА) основана на взаимодействии 
золотистого   стафилококка   штамма   cowan-1,   предварительно 
сенсибилизированного антителами специфической О-сыворотки или 
антиадгезивных сывороток, с О-антигенами сальмонелл и морганелл и 
адгезивными антигенами эшерихий, что приводит к образованию хорошо 
технологических     и  ветеринарно-санитарных     требований воспроизводства 
стада, а также нарушением режимов содержания и кормления молодняка.

1.3. Смешанная кишечная инфекция может протекать в кишечной (энтеритной ) и 
септической формах. При кишечной форме возбудители болезни локализуются   только 
в желудочно-кишечном тракте и брыжеечных  лимфоузлах,  регионарных  пораженным  
участкам кишечника; при септической форме - в паренхиматозных органах, различных 
тканях, а также в кишечнике и брыжеечных лимфоузлах. Основными клиническими 
признаками болезни являются: потеря аппетита, понос, переходящий в профузный, 
нарастающая слабость, депрессия, учащенное дыхание    и сердцебиение, обезвоживание 
организма (при затяжном течении); нередко наблюдается поражение центральной 
нервной системы (возбуждение, судороги), иногда пневмония, артриты; температура 
тела в пределах нормы, в отдельных случаях повышена на 0,5-1 °С,  в предагональном 
состоянии она снижается ниже нормы. 

1.4. Патологоанатомические изменения у погибших животных имеют картину 
катарального или катарально-геморрагического гастроэнтерита, на слизистой желудка, 
тонкого отдела кишечника и слепой кишки могут встречаться язвы, нередко 
отмечаются множественные точечные, полосчатые и пятнистые кровоизлияния на 
слизистой желудка, толстого и тонкого отделов кишечника, под капсулой селезенки, 
эпи- и эндокарде (клапанах); иногда отмечается очаговая катаральная пневмония и отек 
легких, дистрофия печени; регионарные брыжеечные лимфатические узлы как правило 
увеличены, отечны, на разрезе розового или красно-вишневого цвета; при вскрытии 
черепной коробки - гиперемия кровеносных сосудов и отек ткани головного мозга. 
Указанные изменения могут быть в отдельных или одновременно в нескольких органах.

1.5. диагноз на смешанную кишечную инфекцию в хозяйствах устанавливают на 
основании совокупности эпизоотологических данных (возраст заболевших животных, 
массовость поражения, стационарность и др.), клинических признаков болезни, 
патологоанатомической картины и результатов бактериологического (при 
необходимости еще и вирусологического) исследования патологического материала от 
больных или погибших животных.

2. Отбор материала для исследования
2.1.   Для  посмертной  бактериологической  диагностики  в лабораторию 
направляют 2-4 свежих трупа погибших или убитых с диагностической  целью  
больных  животных  (желательно  не подвергавшихся лечению антибактериальными 
препаратами). В случае невозможности доставки целого трупа посылают следующий 
патологический  материал:   голову,  трубчатую  кость,   сердце, перевязанное 
лигатурой вблизи разреза сосудов и аорты, селезенку, долю печени с желчным пузырем, 
брыжеечные лимфатические узлы, регионарные воспаленному участку кишечника, а 
также пораженный отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух концов 
лигатурой (в отдельной таре или полиэтиленовом пакете). Указанный патологический 
материал исследуют в день поступления его в лабораторию.

2.2. Для прижизненной бактериологической диагностики в лабораторию 
направляют фекалии больных диареей животных, не подвергавшихся лечению 
антибактериальными препаратами. Пробы фекалий берут от 5-6 больных животных 
одной фермы в стерильные пробирки по 2-3 г непосредственно из прямой кишки с 
помощью прокипяченного   резинового   катетера.   Пробирки   вместе   с 
сопроводительной запиской упаковывают в полиэтиленовый пакет или картонную 
коробку. При невозможности быстрой доставки проб фекалий в лабораторию (через 3-4 
часа после взятия) их консервируют стерильным 30% - ный глицериновым раствором в 
соотношении 1:2 (см. приложение).

2.3. Пробы фекалий и содержимого тонкого отдела кишечника (в количестве не 
более 0,5 г) разводят в 10 см 3 стерильного 0,85%-ного раствора хлорида натрия, 
тщательно размешивают и затем выдерживают 10-15 минут при комнатной 
температуре для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость используют для 
посева на питательные среды не позднее 1-2 часов после приготовления взвесей. При 
исследовании консервированных фекалий, их тщательно размешивают, после чего 
разводят физиологическим раствором в 5-10 раз.

3. Выделение культур энтеробактерий, изучение их морфологических, 
культуральных и ферментативных свойств.

3.1. Патологический материал (за исключением содержимого тонкого отдела 
кишечника и фекалий) засевают в пробирки с МПБ и на плотные дифференциально-
диагностические среды в чашках: Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-
сульфит агар). Содержимое тонкого отдела кишечника и фекалий засевают только на 
указанные выше плотные среды в чашках. Кроме того для выделения из фекалий 
сальмонелл неразведенные пробы фекалий засевают еще в одну из сред обогащения 
(селенитовый бульон, магниевую, Мюллера или др.) в соотношении 1:5.

3.1.1. Посев материала в МПБ проводят пастеровской пипеткой. Посевы на 
плотные среды в чашках из внутренних органов и тканей, указанных в п.2.3, делают 
путем отпечатков разрезанной поверхностью кусочка органа из предварительно 
профламбированного участка на подсушенную питательную среду или вносят материал 
пастеровской пипеткой на поверхность среды, а затем равномерно растирают его 
стеклянным шпателем.

3.1.2. Содержимое тонкого отдела кишечника, взятое путем соскоба с пораженного 
участка слизистой оболочки, суспендируют в 10 куб.см стерильного 0,85%-ного 
раствора хлорида натрия, затем засевают суспензию бактериологической петлей на 
подсушенные в термостате плотные дифференциально-диагностические среды в 
чашках широким частым штрихом по всей поверхности среды. Аналогичным образом 
проводят посев разведенных фекалий.

3.2. Пробирки с посевами в МПБ из внутренних органов и тканей инкубируют при 
температуре 37-38 °С  в течение 18-24 часов. При наличии в МПБ помутнения среды 
культуру микроскопируют и в случае обнаружения мелких грамотрицательных 
палочек пересевают ее на агар Эндо (или Левина) и среду Плоскирева (или висмут-
сульфит агар) в чашках, которые помещают в термостат (37-38 ° С ) на 18-24 часа.
Пересев культур, полученных в МПБ, на плотные селективные среды проводят в 
том случае, если отсутствует рост колоний на этих средах в первичных посевах из 
соответствующих органов и тканей.

3.3. Чашки с посевами на агаре Эндо (или Левина) из внутренних органов, тканей 
или фекалий инкубируют при температуре 37-38 ° С в течение 18-24 часов. После 
просмотра культур пересевают колонии лактозоположительных бактерий (круглые, 
средних размеров s-формы, красно-малинового цвета на агаре Эндо и темно-
фиолетового цвета на агаре Левина с наличием или отсутствием металлического 
блеска) в чашки с МПА и средой Минка в соответствии с рекомендациями, изло-
женными   в   действующих   «Методических   указаниях   по бактериологической   
диагностике   колибактериспа   (эшерихиоза) животных».

При наличии на агаре Эндо (или Левина) роящегося налета, характерного для 
протея, пересевают его на скошенный МПА (культуры из двух-трех внутренних 
органов, тканей или фекалий). Чашки и пробирки с посевами инкубируют 18-20 часов 
при той же температуре

                               СХЕМА
           БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО 
                МАТЕРИАЛА НА СМЕШАННУЮ КИШЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ

 

3.4. Чашки с первичными посевами на агаре Плоскирева инкубируют при 
температуре 37-38 °С в течение 24-36 часов. После просмотра культур пересевают мелкие 
круглые колонии s-формы полупрозрачные, сероватого цвета с голубым оттенком в 
пробирки со скошенным МПА (по 1-2 колонии с культур из двух-трех внутренних органов, 
тканей или фекалий, каждую колонию в отдельную пробирку), которые помещают в 
термостат на 18-24 часа.

В том случае, если пересев проводят на комбинированную среду (Олькеницкого, 
Клиглера), то каждую колонию пересевают в одну пробирку с этой средой и в одну 
пробирку со скошенным МПА.

3.5. Суточные культуры бактерий на скошенном МПА или комбинированной среде, 
выделенные из внутренних органов, тканей или фекалий, микроскопируют (окраска по 
Граму) и при наличии в мазках однородных мелких грамотрицательных палочек, не 
образующих спор и капсул (бактерии вида klebsiella pneumoniae образуют капсулу), 
используют для изучения ферментативных, патогенных, антигенных свойств, а также (при 
необходимости) определения подвижности в полужидком МПА. Для выявления у культур 
клебсиелл капсулы окраску мазков проводят по методу Гинса (тушью).

3.6. Ферментативные свойства изучают у 2-6 агаровых (в порядке исключения у 
бульонных) культур бактерий, выделенных из одного патологического материала, на 
наборе сред с углеводами и индикатором Андреде или полужидких средах с индикатором 
ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на 
средах с мочевиной, сернокислым железом (определение сероводорода), агаре Симонса, в 
бульоне Хоттингера или МПБ (определение индола), мясо-пептонной желатине, среде с 
фенилаланином.

При использовании комбинированной среды Олькеницкого   или Клиглера 
учитывают изменения, вызываемые представителями разных родов энтеробактерий в этой 
среде, после чего данную культуру изучают по другим необходимым биохимическим тестам.
Засеянные пробирки инкубируют при температуре 37-38 °С. Предварительные 
результаты изучения ферментативных свойств культур учитывают через 24 часа, 
окончательные результаты - через 48 часов. Изучение ферментативных свойств культур 
энтеробактерий можно проводить также с помощью тест-системы для биохимической 
идентификации энтеробактерий. Родовую и видовую принадлежность культур 
устанавливают по показателям таблицы.

Следует учитывать, что у бактерий рода proteus   встречаются нероящиеся штаммы, 
образующие при росте на плотных питательных средах мелкие круглые колонии s-формы 
сероватого цвета. Важными признаками родовой идентификации таких штаммов является 
их способность дезаминировать фенилаланин и разжижать желатин.
При наличии у культур отклонений от основных показателей таблицы используют 
дополнительные тесты: реакции с метилротом и Фогес-Проскауэра, наличия образования 
оксидазы, определение подвижности и др.

4. Серологическая идентификация культур бактерии. 
4.1. Серологическую идентификацию культур эшерихий и сальмонелл проводят в 
соответствии с действующими "Методическими указаниями по бактериологической 
диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных" и "Методическими указаниями по 
лабораторной диагностике сальмонеллезов человека и животных, обнаружению сальмонелл 
в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды".

                Дифференциальные признаки энтеробактерий по ферментативным свойствам

№
п/п

 Т е с т ы

 РОДЫ И ВИДЫ БАКТЕРИЙ

esc-
heri-
chia 
coli

citrobacter

enterobacter

klebsiella 
pneumo-
niae

salmonella 
(подрод 1)

proteus

morg-
anella 
morg-
anii

yersinia 
enteroco-
litica
(t^{0 
22-25 гр.С)}

freu-
ndii

dive-
rsus

aerog-
enes

 cloacae

vulg-
aris

мiга-
bilis

мухо-
faci-
ens

                            ОСНОВНЫЕ

1.

Глюкоза

+(k)

2.

Лактоза

(±)

(±)

(^±)

(±)

^(±)

3.

Сахароза

±

±

±

±

±

4.

Маннит

5.

Мальтоза

±

6.

Рост на агаре Симонса

(±)

±

±

7.

Образование индола

±

±

±

8.

Образование сероводорода

(±)

9.

Расщепление мочевины

±

10.

Разжижение желатины

±

-(+)

11.

Дезаминирование фенилаланина

               ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ

1.

Реакция с метилротом

±

2.

Реакция Фогес-Проскауэра

±

±

3.

Подвижность

±

(±)

(±)

(±)

(±)

Обозначения:    «+» - ферментация сахара (КГ), образование индола, расщепление мочевины и т.д.
                «-» - отсутствие ферментации сахара, образования индола, расщепления мочевины и т.д.
                «±» - различные показатели
                «(-)» - отдельные штаммы не вызывают ферментации сахара, образования индола и т.д. 
                «(+)»- замедленное разжижение желатины

Культуры названных бактерий относят к возбудителям болезни на основании 
показателей, указанных в этих методических указаниях.

4.2. Для серотипирования культур морганелл, выделенных из патологического 
материала, применяют набор нативных морганеллезных агглютинирующих   
серогрупповых   сывороток.   Серологическую типизацию культур осуществляют в 
соответствии с наставлением по применению указанных сывороток, утвержденным 
Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 28.04.1997 г. При выделении   культур 
морганелл патогенной серологической группы их относят    к возбудителям болезни и у 
таких культур патогенные свойства в биопробе на белых мышах не определяют.

4.3. Ускоренное обнаружение эпизоотических штаммов морганелл в первичных  
смешанных  культурах,  полученных  после  посева патологического материала на среду 
Плоскирева, с одновременной серологической типизацией их осуществляют в реакции 
нейтрализации антител (РНАт) в соответствии с "Методическими указаниями по 
ускоренной индикации эпизоотических штаммов морганелл в реакции нейтрализации 
антител", утвержденными Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 24.03.1999 г. Для 
постановки РНАт применяют набор агглютинирующих   морганеллезных   
серогрупповых   сывороток, указанный в п.4.2, и набор морганеллезных эритроцитарных 
диагностикумов, которые используют в соответствии с "Наставлением по применению 
набора    диагностикумов        морганеллезных эритроцитарных", утвержденному 

Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 24.03.1999 г. При обнаружении в реакции 
нейтрализации антител эпизоотических штаммов морганелл серогрупп О1, О16, О26, 
О29, О33, О45, О49, "13" выделение чистых культур дачных бактерий и изучение их 
морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств не проводят.

5. Определение патогенных свойств культур бактерии
5.1. Патогенные свойства определяют у культур бактерий, относящихся к родам 
proteus, citrobacter, klebsiella, а также родам escherichia и morganella, не имеющих 
адгезивные антигены и не типируемых по О-антигену, в биопробе на белых мышах.

5.2. Для определения патогенных свойств бактерий используют агаровые культуры 
вышеуказанных микроорганизмов, выделенные из двух внутренних органов и тканей 
погибших или фекалий больных животных. С каждой из двух культур одного вида 
бактерий готовят смывы стерильным физиологическим раствором, устанавливают 
взвесь бактерий в концентрации 1 млрд. микробных клеток/куб.см (10 единиц по 
оптическому стандарту мутности), после чего их смешивают в равной пропорции.

5.3. Взвесями культур каждого вида бактерий заражают по три белые мыши массой 
14-15 г внутрибрюшинно в дозе 0,5 млрд микробных клеток. Культуру признают 
патогенной в случае гибели двух и более мышей в течение трех суток после заражения и 
относят ее к возбудителю болезни.

5.4. При выделении культур энтеробактерий, относящихся к одному виду того или 
иного рода, указанного в п. 1.1, из селезенки, крови сердца, костного, головного мозга (не 
менее, чем из двух перечисленных органов и тканей) свежего трупа животного 
патогенные свойства этих культур   в биопробе на белых мышах не определяют и их 
серологическую типизацию не проводят; такие культуры относят к возбудителю болезни.

6. Учет результатов бактериологического исследования 6.1. Бактериологический 
диагноз на смешанную кишечную инфекцию молодняка сельскохозяйственных 
животных устанавливают на основании выделения из патологического материала 
культур, принадлежащим к двум и более родам энтеробактерий, указанных в п.1.1, и 
относящихся к возбудителям болезни по одному из показателей, изложенных в 
п.п.4.1,4.2,5.3,5.4.

6.2.    Результаты    бактериологического    исследования формулируют: «Из 
присланного патологического материала (указать какого) выделены возбудители 
смешанной кишечной инфекции (указать какие виды бактерий, типы адгезивных 
антигенов у энтеропатогенных эшерихий, серогруппу в случае серотипирования 
культур эшерихий и морганелл)».

6.3.   При   необходимости   определяют   антибиотикочувствительность   
каждого   вида   выделенной   культуры возбудителя кишечной инфекции в 
соответствии с действующими «Методическими указанию по определению 
чувствительности к антибиотикам     возбудителей     инфекционных     болезней 
сельскохозяйственных животных».

6.4.   Общий  срок  бактериологического   исследования патологического 
материала до 7 суток.

Методические указания разработаны Л.С. Кавруком, С.В. Бритовой, А.Б. 
Кононенко (ВНИИ ветсанитарии, гигиены и экологии), В.А. Седовым, Л.А. 
Тарановой (Центральная научно-методическая ветлаборатория Минсельхозпрода 
РФ).

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу 
"Методические указания по бактериологической диагностике смешанной 
кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными 
энтеробактериями", утвержденные ГУВ Министерства сельского хозяйства и 
продовольствия СССР 12 ноября 1991г.