МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
              ПО ПРОВЕДЕНИЮ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ РЫБ




1.Общие положения.
2.Взятие крови.
3.Приготовление и окраска мазков крови.
4.Определение содержания гемоглобина.
5.Определение гематокритной величины.
6.Определение белка в крови.
7.Определение числа эритроцитов пробирочньм методом в камере Горяева.
8.Определение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ).
9.Определение среднего объема эритроцитов.
10.Определение скорости оседания эритроцитов.
11.Оценка эритроцитарной картины крови рыб.
12.Определение общего числа лейкоцитов.
13.Выведение лейкоцитарной формулы.
14.Определение метгемоглобина

Приложения









    МИНИСТЕРСТВО
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
 РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                         УТВЕРЖДАЮ
                                          Заместитель руководителя
                                          Департамента ветеринарии
№ 13-4-2/1487 от 02 февраля 1999 г.           В.В.Селиверстов

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по проведению гематологического
обследования рыб

1. Общие положения.

Необходимым  условием  успешного  ведения  интенсивного  рыбоводства  и
воспроизводства ценных видов рыб является тщательный контроль за физиологическим
состоянием объектов выращивания. Кровь, как наиболее лабильная ткань, быстро реагирует на
действие различных факторов и приводит к восстановлению равновесия между организмом и
средой. Поэтому для ранней диагностики заболеваний, в том числе и незаразных, наряду с
паразитологическими, микробиологическими и вирусологическими исследованиями важное
значение имеет анализ крови.

В рыбоводстве при гематологическом исследовании принято определять следующие
показатели крови:

- количество гемоглобина,
- величину гематокритного числа,
- содержание общего белка в сыворотке крови,
- число эритроцитов,
- содержание гемоглобина в одном эритроците,
- средний объем эритроцитов,
- скорость оседания эритроцитов,
- число лейкоцитов,
- лейкоцитарную формулу,
- количество метгемоглобина.

В приложение вынесены таблицы, содержащие показатели крови здоровых рыб
(приложения № № l - 8).

2. Взятие крови.

2.1 Оборудование и реактивы:

- шприц с инъекционными иглами - стерильные,
- пастеровские пипетки - стерильные,
- часовое стекло,
-5 % раствор натрия цитрата или 0,2 % раствор гепарина (1.000 ЕД/мл),
- анестетики,
- спирт,
- марля, вата.

2.2. Материал для исследования, ход работы.

Кровь берут у голодной рыбы, выдержанной в хорошо аэрированной воде в течение 5-10
минут после отлова. Если это невозможно, то пойманную рыбу следует сразу помещать в ведро
с водой из водоема в соотношении 1:10, содержащей релаксирующую концентрацию одного из
анестетиков: пропаксат (0,6 - 0,8 мг/л), хиналдин (25 - 30 мг/л), серный эфир (1 - 1,5 %) и др.
Вода, в которой находится анестезированная рыба, должна постоянно аэрироваться.

В зависимости от размера объекта и необходимого количества крови кровь берут
несколькими способами: из сердца, жаберной вены, хвостовой артерии, отсечением хвоста.

Место пункции после снятия чешуи обрабатывают 70° спиртом и высушивают ватным
тампоном для удаления слизи. Для взятия крови чаще используют шприц с инъекционной
иглой либо пастеровскую пипетку. Инструменты предварительно обрабатывают водным
раствором антикоагулянтов: цитрата натрия или гепарина. Место взятия крови нельзя сжимать
во избежание попадания тканевой жидкости, искажающей результаты. Повторно брать кровь из
одного и того же места не рекомендуется. Анализируемая кровь должна быть свежей, жидкой.
Во избежание разрушения эритроцитов (гемолиза) кровь берут в подготовленные пробирки
(или часовое стекло), сливая осторожно по стенке.

3. Приготовление и окраска мазков крови.

По окрашенным мазкам крови ведут оценку активности эритропоэза и учет лейкоцитов.

3.1. Оборудование и реактивы:

- обезжиренные предметные стекла,
- шлифованное стекло для изготовления мазка,
- краска Май-Грюндальда,
- рабочий раствор краски азур-эозина (по Романовскому),
- дистиллированная вода с рН 6,8 - 7,1, нейтрализованная фосфатными
буферами.

3.2. Подготовка к исследованию.

3.2.1. Подготовка предметных стекол.

- один конец стекла размером в 1-1,5 см шлифуют на наждаке для надписи простым
карандашом,

- стекла кипятят в 1%-ном растворе двууглекислой соды -10 мин,
- охлаждают и промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой -5 мин.,
- стекла помещают в слегка подкисленный соляной кислотой раствор дистиллированной
воды на 2-3 мин; затем дважды промывают дистиллированной водой, высушивают на
воздухе или в сушильном шкафу и хранят в смеси спирта с эфиром 1:1. Перед
употреблением их вынимают, насухо вытирают чистой салфеткой или фильтровальной
бумагой. Они готовы к использованию.

3.2.2. Приготовление рабочего раствора краски азур - эозина:

- 5,5 мл концентрированной краски азур - эозина помещают в 250 мл нейтральной
дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

3.3. Ход работы.

Кровь после взятия (см. п. 2.) наносят в виде небольшой капли на заранее
приготовленное обезжиренное предметное стекло, на расстоянии 1,5-2 см от его шлифованного
края. Большим и указательным пальцами правой руки берут шлифованное стекло за боковые
ребра, ставят на предметное стекло под углом 45° и подвигают тыльной стороной к капле,
которая от соприкосновения растекается. Скользящим движением продвигают шлифованное
стекло вперед. Кровь должна равномерно распределяться по предметному стеклу в виде мазка.
От каждой рыбы готовят не менее двух мазков. После приготовления мазка его высушивают на
воздухе в течение 10-15 минут.

Подсохшие мазки без фиксации окрашивают по Паппенгейму (Романовскому - Гимза).
Первый этап - окрашивание и фиксация и одновременно раствором Май-Грюнвальда в течение
5 минут, затем промывают нейтральной дистиллированной водой.     Второй этап -
докрашивание в рабочем растворе Романовского 30-40 минут. Качество окраски клеток
контролируют под малым увеличением микроскопа. Окрашенные мазки промывают
водопроводной водой и высушивают на воздухе.

4. Определение содержания гемоглобина.

Гемоглобин - это дыхательный пигмент, содержащийся в эритроцитах. Его количество в
организме выражается в г/л и имеет важное диагностическое значение. Определять содержание
гемоглобина можно двумя способами: по Сали и цианметгемоглобиновым методом. Наиболее
распространенным и простьм является метод определения гемоглобина по Сали. Однако он
дает ряд объективных (постепенное усиление окраски) и субъективных (визуальное сравнение
цвета) ошибок. Цианметгемоглобиновый метод является наиболее точным.

4.1. Метод определения гемоглобина по Сали.

4.1.1. Подготовка к исследованию.

Приготовление 0,1 н. раствора соляной кислоты:

- на 1 л дистиллированной воды добавляют химически чистой 8,2 см3 соляной
кислоты с удельным весом 1,19, либо 0,1 н. фиксанал соляной кислоты.

4.1.2. Оборудование и реактивы.

- гемометр Сали,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- глазная пипетка,
- стеклянная палочка,
- часовое стекло,
- 0,1 н. раствор соляной    кислоты,
- дистиллированная вода.

4.1.3. Ход определения и учет результатов.

В градуированную пипетку гемометра Сали до метки "2" глазной пипеткой наливают
децинормальный раствор соляной кислоты. В капиллярную пипетку от гемометра Сали
набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают ее в раствор соляной кислоты. Полученную смесь
перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени в
пробирку по каплям доливают дистиллированную воду и, перемешивая стеклянной палочкой,
подбирают цвет рабочего раствора до совпадения с цветом жидкости в стандартных пробирках.
Количество гемоглобина отсчитывают по нижнему мениску рабочего раствора на
градуированной пробирке (показатели в г % выражают в г/л), 1 г % равен 10 г/л.

4.2. Цианметгемоглобиновый фотометрический метод.

4.2.1. Подготовка к исследованию.

Приготовление раствора Драбкина, на 1 л реактива берут:

бикарбонат натрия -1 г, красная кровяная соль - 0,2 г, цианистый калий или
натрий - 0,05 г, дистиллированная вода - остальной объем.

4.2.2. Оборудование и реактивы:

- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр с зеленым
светофильтром и   кюветами толщиной 1 см;

- химические пробирки с пробками;
- капиллярная пипетка от гемометра Сали объемом 20 мкл;
- градуированная пипетка на 5 мл;
- раствор Драбкина.

4.2.3. Ход определения и учет результатов.

Мерной пипеткой в пробирку наливают 5 мл трансформирующего раствора Драбкина.
Пипеткой от гемометра Сали добавляют 20 мкл крови. Содержимое пробирки хорошо
перемешивают и оставляют в холодильнике на 20 минут. По истечению этого времени рабочий
и трансформирующий растворы наливают в кюветы и, используя зеленый светофильтр,
проводят измерения на ФЭКе. Расчет концентрации гемоглобина (г/л) на основе данного
определения проводят по формуле:

x=d540 * 367,1 г/л, где:

d540 - показания ФЭК;

367,1 - коэффициент пересчета, учитывающий разведение крови,
миллимолярный вес гемоглобина и другие показатели.

5. Определение гематокритной величины.

Гематокритное число - это отношение объема эритроцитов к общему объему крови,
выраженное в л/л (1 л/л равен 100 %).

5.1. Подготовка к исследованию.
Приготовление растворов антикоагулянта:

- раствор Геллера и Пауля:

на 100 мл воды: щавелевокислый аммоний -1,2 г, щавелевокислый калий - 0,8 г;

- 5 % раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия.

5.2. Оборудование и реактивы:

- микрокапилляры,
- центрифуга, при массовом отборе проб удобнее использовать специальную
центрифугу МГЦ - 8,
- растворы антикоагулянтов: раствор гепарина 1000 ЕД/мл или 7,7 мг/мл, или
раствор Геллера и Пауля, или 5% раствор лимоннокислого натрия.

5.3. Ход определения и учет результатов.

Микрокапилляры предварительно обрабатывают одним из растворов антикоагулянта.
Можно несколько раз сполоснуть их раствором гепарина и высушить при комнатной
температуре или же в капилляры насасывают на 1/10 часть раствора Геллера и Пауля и
высушивают в сушильном шкафу при 60°С. В подготовленные таким образом капилляры
набирают кровь. Конец капилляра закупоривают с помощью замазки и ставят
центрифугировать до получения постоянного объема эритроцитов. Время центрифугирования
зависит от скорости вращения центрифуги. Достигают эффекта полного осаждения
эритроцитов. Отсчет объема эритроцитов и плазмы производят при помощи миллиметровой
линейки. Процентное отношение столба эритроцитов к высоте всего столба крови является
гематокритной величиной, которое переводят в размерность л/л.

6. Определение белка в сыворотке крови.

Содержание белка в сыворотке крови рыб служит экспресс - тестом для определения
уровня физиологического состояния рыб при выращивании в современных рыбоводных
хозяйствах. Концентрацию белка выражают в г % или в г/л; 1 г/л равен 10г %.

6.1. Оборудование и реактивы:

- уленгутки или небольшие пробирки,
- штатив,
- центрифуга,
- рефрактометр,
- пастеровские пипетки,
- спирт.

6.2. Ход определения и учет результатов.

2 - 3 мл крови, полученной одним из методов (см. п.2.), помещают в подготовленные
уленгутки или небольшие пробирки. После этого кровь центрифугируют 5 минут при 3000
об./мин. В случае отсутствия центрифуги проводят отстаивание крови в холодильнике 30 - 45
минут. Полученная после центрифугирования или отстаивания сыворотка отсасывается чистой
пастеровской пипеткой и несколько ее капель помещают на пластинку рефрактометра.
Регистрируют показатель преломления по его шкале. По таблице 1, приведенной ниже,
определяют содержание белка в сыворотке крови. После каждого исследования обе
поверхности призм протирают марлевьм тампоном, смоченным в спирте.

7. Определение числа эритроцитов пробирочньм методом в камере Горяева.

Число эритроцитов (в млн. в 1 мкл) - важный показатель физиологического состояния
рыб, который характеризует наличие анемии.

7.1. Подготовка к исследованию.
Приготовление раствора Хендрикса:

- сульфат натрия - 20 г, хлористый натрий - 5 г, цитрат натрия трехзамещенный - 3 г,
ледяная уксусная кислота -100 мл, вода дистиллированная до 1000 мл.

7.2. Оборудование и реактивы;

- химические пробирки с пробками,
- градуированная пипетка на 5 мл,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- пастеровская пипетка,
- камера Горяева,
- микроскоп,
- раствор Хендрикса.

7.3. Ход определения и учет результатов.

Градуированной пипеткой в химическую пробирку наливают 4 мл раствора Хендрикса.
В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают в
пробирку, осторожно промывая капилляр несколько раз. Покровное стекло притирают к
камере Горяева до появления ньютоновских колец. Содержимое пробирки тщательно
перемешивают и пастеровской пипеткой заполняют камеру Горяева. Через 1-2 минуты
начинают подсчет числа эритроцитов под микроскопом в 5 больших или 80 малых квадратах,
расположенных по диагонали. Для определения количества эритроцитов в 1 мкл достаточно
умножить полученное при подсчете число эритроцитов на 10000.