ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ

МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

i7.08.98г. № 13-7-2/1357

ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора реагентов для
определения прогестерона в молоке коров
методом иммуноферментного анализа для
ранней диагностики стельности ( ИФА-АФ-ПРОГ.)
(В порядке широкого производственного
испытания на 10 000 000 исследований, до 2001г)

1. НАЗНАЧЕМЕ

В настоящее время стельность коров в странах ЕЭС,США и Канаде
принято выявлять на 21 сутки после осеменения. Для этого в молоке ко-
ров или сыворотке крови нетелей определяют концентрацию видонеспецифи-
ческого гормона прогестерона. Концентрация прогестерона у коров пре-
терпевает циклические изменения: менее 2 нг/мл или 6,37 нмоль/л во
время овуляции (или течки), затем постепенно возрастает до максимума
(10 нг/мл.) на 13-15 сутки. Если стельность не наступает, то между 17
и 21 днями после последней течки количество прогестерона быстро пада-
ет, что указывает на начало следующего цикла созревания яйцеклетки.
Уровень прогестерона в молоке коррелирует с содержанием его в крови.
Если животное становится стельным, то высокая концентрация гормона
сохраняется.

Динамика прогестерона в молоке в течение полового цикла.

Разработанный набор реагентов предназначен для количественного и
качественного определения прогестерона в молоке коров методом иммуно-
ферментного анализа для ранней диагностики стельности.

Целесообразность раннего выявления стельности путем определения
концентраций прогестерона в молоке коров обусловлена следующим:

- данная технология исключает передачу инфекционных заболеваний,
в первую очередь, вируса лейкоза крупного рогатого скота, от одного
животного другому или человеку ( в отличие от технологии ручного опре-
деления стельности коров );

- позволяет значительно сократить сервис-период и, благодаря это-
му, приносит существенный экономический эффект (экономический эффект
от использования аналогичной технологии в Англии ежегодно приносит 70
фунтов стерлингов от каждой коровы);

- позволяет в более ранние сроки начать необходимое лечение жи-
вотного:

- исключает стресс животного и не содержит отрицательного эмоцио-
нального фона для человека.

Кроме того, данный метод количественного анализа может быть тес-
том выявления таких функциональных нарушений яичников, как гипофунк-
ция, фолликулярная или лютеиновая кисты, персистентное желтое тело,
при которых самок необходимо лечить.

В основе количественного определения прогестерона в биологических
жидкостях животных лежит конкурентный вариант твердофаэного иммунофер-
ментного анализа. Принцип метода основан на конкуренции между адсорби-
рованным на поверхности лунок планшета прогестероном и свободным (в
калибровочной пробе или анализируемом образце) прогестероном за актив-
ные центры связывания аффинных антител к прогестерону, меченых перок-
сидазой. В результате иммуноспецифической реакции между антителами к
прогестерону и самим прогестероном, содержащимся в пробах (стандарты
или образцы) и на поверхности лунок планшета образуются комплексы ан-
тнтела-прогестерон. Комплекс антиген-антитело, не связанный с поверх-
ностью планшета, удаляют путем промывки.

В результате ферментативной реакции пероксидазы с перекисью водо-
рода субстратного раствора происходит окрашивание 3,3',5,5'- тетраме-
тилбензндина (ТМВ) в синий цвет. Интенсивность окраски обратно пропор-
циональна содержанию прогестерона в анализируемом образце. Реакцию ос-
танавливают добавлением серной кислоты, вызывающей смену окраски с си-
ней на ярко желтую. Результаты реакции оцениваются на спектрофотометре
вертикального сканирования при длине волны 450 нм.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

2.1. Набор расчитан на проведение анализа 6 калибровочных проб,
1 контрольного образца и 41 исследуемой пробы в дубликатах на каждом
планшете.

2.2.Состав набора:

1.Планшет 96-луночный с адсорбированным антигеном - 1(2)шт.

2.Калиброванные стандарты прогестерона,
лиофиллизированные (аморфная пасса белого цвета) или жидкие
(жидкость белого цвета по 0,5 мл):

а) Стандарт О нг/мл - 1 фл.

б) Стандарт 1,1 нг/мл - 1 фл.

в) Стандарт 3,3 нг/мл - 1 фл.

г) Стандарт 10,0 нг/мл - 1 фл.

д) Стандарт 30 нг/мл - 1 фл.

е) Стандарт 90,0 нг/мл - 1 фл.

ж) Контрольный образец - 7,5 нг/мл - 1 фл.
лиофиллизированный (аморфная масса белого цвета) или жидкий
(жидкость белого цвета по 0,5 мл):

3. Растворитель для стандартов и контрольного образца - 1 фл.
(бесцветная прозрачная жидкость - 5 мл)

4. Коньюгат аффинных антител к прогестерону и пероксидазы - 1 фл.
из корня хрена, ( жидкость красного или желтоватого цвета
- 0,3 или 0,6 мл)

5. Буфер для анализа n 1 ( жидкость желтоватого цвета - 1 фл.
- 0,3 или 0,6 мл)

6. Буфер для анализа n 2 ( жидкость красного или - 1 фл
желтоватого цвета - 0,3 или 0,6 мл)

7. ФСБР - фосфатно-солевой буферный раствор с - 1 фл.
детергентом, 20-кратный концентрат (бесцветная прозрачная
жидкость - 25 или 50 мл)

8. 3,3',5,5'- тетраметилбензидин (ТМБ) - 1 фл.
(прозрачная жидкость голубоватого цвета -2,2 или 4,4 мл)

9. Субстратный раствор (бесцветная прозрачная жидкость - - 1 фл.
8,8 или 17,6 мл)

10. Стоп-реагент (серная кислота, 2н) - 1 фл.
(бесцветная прозрачная жидкость - 11 или 22 мл)

2.3.Маркировка.

2.3.1. На каждый флакон с компонентом должна быть наклеена эти-
кетка с указанием: наименования предприятия-изготовителя и его товар-
ного знака, названия набора, названия реагента, способа подготовки к
работе ( для отдельных компонентов), условий хранения, срока годности,
номера серии, объема реагента, надписи "Только для "ин витро" диагнос-
тики" , содержания прогестерона (для калиброванных стандартов и раство-
ров) .

2.3.2. На каждую коробку должна быть наклеена этикетка с указани-
ем: наименования предприятия-изготовителя и его товарного знака, наз-
вания набора, состава набора, надписи "Только для "ин витро" диагнос-
тики", условий хранения, срока годности, номера серии, номера настоя-
щих технических условий. В коробку вкладывают наставление по примене-
нию.

3.ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ

3.1. Транспортирование наборов производят в соответствии с ОСТ
08064-19-07 всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 8 гр.С.
Допускается транспортирование наборов при температуре до 25гр.С в тече-
ние 1 сут.

3.2. Наборы хранят при температуре от 2 до 8гр. С в течении всего
срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25гр. С
не более 1 сут.

3.3. Срок годности набора - 6 мес. со дня изготовления.
Датой изготовления набора считают дату его комплектации.

4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

4.1. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые
или пластиковые перчатки, так как исследуемый материал является потен-
циально инфицированным, способным длительное время сохранять и переда-
вать бактериальные или вирусные инфекции.

4.2. Химическая посуда и оборудование, которые используются в ра-
боте с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и хра-
ниться отдельно.

4.3. Запрещается прием пищи, использование косметических средств.
и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

5 . ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ

5.1. Приготовление Промывочного буфера.

Перед использованием добейтесь полного растворения солей фосфат-
но-солевого буферного раствора (ФСБР) путем прогревания флакона в го-
рячей воде. Смешайте необходимое для работы количество ФСБР с дистил-
лированной водой в следующей пропорции: 1 часть ФСБР + 19 частей дис-
тиллированной воды. Неиспользованный ФСБР храните при 4е С.

5.2. Приготовление калибровочных проб.

Во все флаконы, с калибровочными пробами прогестерона внести по
500 мкл Растворителя для стандартов и контрольного образца (если пробы
лиофиллизироааны) и тщательно перемешать, избегая вспенивания, до пол-
ного растворения аморфной массы.

Пробы стандартов после внесения Растворителя для стандартов и
контрольного образца необходимо поместить в термостат (t=+37°c) на 30
минут. Перед внесением стандартов и проб необходимо добиться их одно-
родности путем тщательного встряхивания.

5.3. Конъюгат

Рабочий раствор Конъюгата готовится непосредственно перед исполь-
зованием и хранению, а отличие от исходного раствора, не подлежит.

Для работы на целом планшете требуется 20 мл рабочего раствора
Конъюгата. Для приготовления рабочего раствора в первую очередь до-
бавьте 250 мкл Буфера n1 к 20 мл свежеприготовленного Промывочного бу-
фера, раствор перемешайте. К этому раствору добавьте по 250 мкл Буфера
для анализа n2 и Конъюгата, перемешайте. Неиспользованный исходный
раствор Конъюгата храните при + 4°С.

5.4. Хромоген

Смешайте содержимое флаконов ТМБ и субстратного раствора в соот-
ношении: 1 часть раствора ТМБ и 4 части субстратного раствора, переме-
шайте. Для работы с растворами хромогена необходимо использовать толь-
ко чистую посуду и чистые наконечники.(Раствор готовится непосредс-
твенно перед употреблением). Оставшиеся неиспользованными исходные
растворы храните при + 4°С.

6. ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

При подготовке к проведению гормональных исследований нужно учи-
тывать два важных момента: необходимость соблюдения стандартных усло-
вий :

- пробы молока необходимо брать в одно и то же время дойки, так
как концентрация прогестерона, связанная с содержанием жира в молоке
возрастает от начала к концу доения. Рекомендуется отбирать пробы мо-
лока вручную в конце основной утренней дойки в объеме 1-1,5 мл

- пробы молока до анализа могут храниться при +2 - +4° С в тече-
ние 3 суток или в течение 1 месяца при -20° гр.С.

- транспортировка без охлаждения допустима в течение 1 суток,

- перед использованием пробы подлежат прогреванию (30 минут при
+37° С) и тщательному встряхиванию перед внесением в лунки планшета.

Результаты наших исследований показали, что оптимальный срок от-
бора проб молока для ранней диагностики стельности - 21 день после
осеменения, когда концентрация прогестерона в молоке нестельных коров
падает до минимальных значений, а у стельных остается на высоком уров-
не .

7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

А. Количественный анализ

7.1. Порядок маркировки планшета и внесения образцов приведен на
схеме. Время внесения образцов в лунки одного планшета не должно пре-
вышать 15 мин.

7.2. Вскрыть упаковку со стрипами (с планшетом), вставить стрипы
в рамку, внести во все используемые лунки по 300 мкл Промывочного бу-
фера и оставить на 1 минуту.

7.3. Удалите содержимое переворачиванием планшета или отсасывани-
ем так, чтобы в лунке не осталось жидкости.

7.4.В лунки ряда А внести по 50 мкл калибровочном пробы, содержа
щей 0,0 нг/мл прогестерона.

СХЕМА ВНЕСЕНИЯ ОБРАЗЦОВ

1 2 3 4

А 0 0 Х2 Х2
В 1,1 1,1 x3 x3
С 3,3 3,3, Х4 Х4
d 10 10 Х5 Х5
Е 30 30 Х6 Х6
f 90 90 Х7 Х7
g К.о. К.о. Х8 Х8
Н Х1 Х1 Х9 Х9

и т .д.

7.5.В лунки ряда В внести по 50 мкл калибровочной пробы, содержа-
щей 1,1 нг/мл прогестерона.

7.6.В лунки ряда С внести по 50 мкл калибровочной пробы, содержа-
щей 3,3 нг/мл прогестерона.

7.7.В лунки ряда d внести по 50 мкл калибровочной пробы, содержа-
щей 10,0 нг/мл прогестерона.

7.8.В лунки ряда Е внести по 50 мкл калибровочной пробы, содержа-
щей 30,0 нг/мл прогестерона.

7.9. В лунки ряда f внести по 50 мкл калибровочной пробы, содер-
жащей 90,0 нг/мл прогестерона.

7.10. В лунки ряда g внести по 50 мкл контрольного образца, со-
держащего 7,5 нг/мл прогестерона.

7.11.В оставшиеся лунки внести в дубликатах по 50 мкл анализируе-
мые образцы (x) молока.

7.12.В лунки планшета со стандартами и анализируемыми образцами
внести по 200 мкл раствора Конъгогата.

7.13.Планшет закрыть крышкой или клеющей бумагой и инкубировать
планшет в течение 30 минут при температуре +37° С.

7.14.После окончания времени инкубации жидкость из лунок удалить
переворачиванием планшета или отсасыванием. Немедленно внести во все
лунки планшета по 300 мкл Промывочного буфера,после чего жидкость из
лунок вновь немедленно удалить переворачиванием планшета или отсасыва-
нием. Процедуру повторить еще 4 раза. После последней промывки в лун-
ках не должно содержаться жидкости.

7.15. Во все "рабочие" лунки планшета внести по 100 мкл раствора
Хромогена и инкубировать в течении 7-15 минут при температуре +37° С в
термостате.

7.16.В те же лунки планшета к раствору Хромогена добавить по 100
мкл Стоп-реагента для остановки ферментативной реакции.

7.17. Измерить оптическую плотность (ОП) всех лунок планшета на
фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм.
Окраска стабильна в течении 30 минут.

Б. Качественный анализ

СХЕМА ВНЕСЕНИЯ ОБРАЗЦОВ

1 2

А К.0. К.0.
В Х1 Х1
С Х2 Х2
d ХЗ ХЗ
Е Х4 Х4
f Х5 Х5
g Х6 Х6
Н Х7 Х7

и т.д.

7.2. Вскрыть упаковку со стрипами (с планшетом), вставить необхо-
димое для работы количество стрипов в рамку, внести во все используе-
мые лунки по 300 мкл Промывочного буфера и оставить на 1 минуту.

7.3. Удалите содержимое переворачиванием планшета или отсасывани-
ем так, чтобы в лунках не осталось жидкости.

7.4.В лунки ряда А внести по 50 мкл калибровочной пробы, содержа-
щей контрольный образец,содержащий 7,5 нг/мл прогестерона.

7.5.В оставшиеся лунки внести в дубликатах по 50 мкл анализируе-
мые образцы (x) молока.

7.6.В лунки планшета с контрольным и анализируемыми образцами
внести по 200 мкл раствора Коньюгата.

7.7.Планшет закрыть крышкой или клеющей бумагой и инкубировать
планшет в течение 30 минут при температуре +37° С.

7.8.После окончания времени инкубации жидкость из лунок удалить
переворачиванием планшета или отсасыванием. Немедленно внести во все
лунки планшета по 300 мкл Промывочного буфера,после чего жидкость из
лунок вновь немедленно удалить переворачиванием планшета или отсасыва-
нием. Процедуру повторить еще 4 раза. После последней промывки в лун-
ках не должно содержаться жидкости.

7.9. Во все используемые лунки планшета внести по 100 мкл раство-
ра Хромогена и инкубировать в течении 7-15 минут при температуре +37°
С в термостате.

7.10.В те же лунки планшета к раствору Хромогена добавить по 100
мкл Стоп-реагента для остановки ферментативной реакции.

7.11.Оценка результатов анализа проводится при длине волны 450 нм
на спектрофотометре типа "УНИПЛАН". Допустимо также оценивать резуль-
таты методом визуального сравнения интенсивности окрашивания растворов
в лунках с анализируемыми пробами с интенсивностью окрашивания в лун-
ках с контрольным образцом.

8. РАСЧЕТЫ И ГРАФИЧЕСКИЕ ПОСТРОЕНИЯ

Оптическую плотность (ОП) субстратного раствора после остановки
ферментативной реакции измеряют на спектрофотометре "Униплан" ЗАО
"ПИКОН" или приборе аналогичного класса при длине волны 450 нм. Прог-
раммное обеспечение прибора позволяет получать результаты измерений в
виде графического построения калибровочной кривой и конечных концент-
раций прогестерона в анализируемых образцах. При использовании прибо-
ров с отсутствием программного обеспечения обработки результатов, не-
обходимо провести графические построения и расчеты концентраций про-
гестерона вручную. Для этого необходимо:

а) Вычислить среднее арифметическое значение ОП лунок, содержащих
одни и те же стандарты или пробы: 1А и 2А ;1В и 2В;1С и 2С и т.д.

б) Разделить полученные значения ОП калиброванных стандартов и
неизвестных проб ( Вх ) на полученное значение ОП в О стандарте ( Во)
и умножить полученные величины на 100% .

в) Построение калибровочной кривой.

Калибровочную кривую строят на полулогарифмической бумаге, откла-
дывая по оси абсцисс (логарифмическая ) концентрации прогестерона
(нг/мл), а по оси ординат (линейная) - полученные значения Вх /Во х
100% в калибровочных стандартах. Для определения содержания прогесте-
рона, в исследуемой пробе необходимо расчитать величину Вх/Во х100%
для данной пробы и по калибровочной кривой установить концентрацию
прогестерона. Типичная калибровочная кривая, полученная с использова-
нием набора ИФА-АФ-ПРОГ,представлена на рис.

9. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

9.1. Наличие разборного планшета и жидких компонентов набора
ИФА-АФ-ПРОГ. позволяет проводить единичные анализы.

9.2. Диапазон измеряемого содержания общего прогестерона в молоке
коров составляет 1,1 -90,0 нг/мл.

9.3. Минимальное содержание прогестерона, определяемое с помощью
набора ИФА-АФ-ПРОГ., составляет 0,8 нг/мл.

9.4. Специфичность антител к прогестерону:

Стеромд Перекрестная реакция ,%

Прогестерон 100
11а-Гидроксипрогестерон 1,2
17в-Гмдроксипрогестерон 3,5
Эстрадмол <0,01
Эстрон <0,01
Эстриол <0,01
Кортизол <0,01
Тестостерон <0,01
5а-Прегнан 3.20 дион 6,7
Прегненолон 2,1

9.5. Тест на "открытие". Данный параметр проверяется путем смеши-
вания равных объемов контрольного образца и калибровочной пробы, со-
держащей 30,0 нг/мл прогестерона.Отклонение определяемого содержания
прогестерона от рассчитанного находится в пределах +15 %.

9.6. Тест на "линейность". Зависимость содержания прогестерона от
разведения калибровочных проб находится в диапазоне 85-115 %.

9.7. Воспроизводимость результатов. Коэффициент вариации резуль-
татов измерения содержания прогестерона в образцах сыворотки крови че-
ловека,полученных с помощью набора ИФА-АФ-ПРОГ., не превышает 12 %.

9.8. Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора
ИФА-АФ-ПРОГ.уточнить значения содержания прогестерона, соответствующие
нормальным.

10. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ТЕСТА

При уровне прогестерона в молоке - 10+- 2,5 нг/мл на 21 день пос-
ле осеменения животное считается стельным. В молоке нестельных коров
концентрация прогестерона не достигает 5 нг/мл, причем, в этом случае
точность диагноза на отсутствие стельности достигает 100%.

Помимо ранней диагностики стельности количественное определение
прогестерона в молоке позволяет подтвердить половую охоту и овуляцию,
а также выявить патологии половых органов. Так, низкий уровень прогес-
терона в молоке на 21 день после осеменения позволяет с высокой сте-
пенью надежности предсказать время наступления очередной половой охоты
и, тем самым, усилить контроль со стороны техника-осеменителя и ветс-
пециалнстов за бесплодными животными. Определением прогестерона во
время половой охоты можно установить в оптимальные ли сроки проведено
осеменение самки. Низкое содержание прогестерона свидетельствует о на-
личие фолликула в яичнике, а его возрастание- об образовании желтого
тела. Половую охоту у коровы считают явной при содержании прогестерона
в молоке не превышающим 2 нг/мл. Наличие более 3,3 нг/мл прогестерона
- указывает на отс/тствие половой охоты у самок. У таких животных не-
обходимо определять уровень прогестерона в молоке с интервалом в 3-5
суток и при концентрации 2 нг/мл и ниже провести повторное осеменение
в течение суток.

Определение прогестерона в молоке позволяет выявить такие функци-
ональные нарушения яичников,как гипофункция, кисты, персмстентное жел-
тое тело, при которых самок необходимо лечить. У коров с фолликулярны-
ми кистами отсутствует желтое тело, основным гормоном которого являет-
ся прогестерон. На 11-16 день полового цикла, когда в норме происходит
прогрессивное возрастание концентрации прогестерона у нормально цикли-
рующих коров, содержание его у бесплодных животных не превышает ба-
зального уровня. При лютеиновой кисте отмечают постоянно повышенный
уровень прогестерона в молоке, незначительно меньший, чем при функцио-
нирующем желтом тепе. После проведения соответствующего лечения путем
исследования концентрации прогестерона в молоке можно проконтролиро-
вать восстановление репродуктивной функции у самок.

При качественном анализе, стельными считаются животные, у которых
интенсивность окраски растворов в лунках с образцами, меньше интенсив-
ности окраски пробы, содержащей 7,5 нг/мл прогестерона.

11. ПОРЯДОК ПРЕДСТАВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

Рекламации на наборы реагентов для определения прогестерона в мо-
локе коров методом иммуноферментного анализа для ранней диагностики
стельности направляют во Всероссийский государственный научно-исследо-
вательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринар-
ных препаратов (ВГНКИ) (123022, г. Москва, Д-22, Звенигородское шоссе,
д.5), предприятию-изготовителю и в Центральную научно-методическую ла-
бораторию (ЦНМВЛ) (111622,г. Москва, улица Оранжерейная, дом 23) в со-
ответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России n 22-7/28 от 08.05.92 г.

"О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного
производства и закупаемые по импорту"; одновременно с рекламацией в
адрес ВГНКИ направляют одну тест-систему.

Наставление разработано:

ТОО "М.А.В." (Н.Г. Матрешина, А.В. Матрешин), МГАВМиБ им. К.И. Скря-
бина ( Н.П. Лысенко) и Центральной научно-методической ветеринарной
лабораторией (В.А. Седов).