ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ

МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

17.08.98г. № i3-7-2/i356

ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора реагентов для
количественного определения проге-
стерона в биологических жидкостях
животных методом иммуноферментного
анализа ( ИФА-АФ-ПРОГ.)
(В порядке широкого производствен-
ного испытания на 1000 000 исследо-
ваний до 2001 года)

1. НАЗНАЧЕНИЕ

Прогестерон является основным представителем гестагенов, продуци-
руемым в организме самок главным образом желтым телом. Секреция про-
гестерона желтым телом способствует успешной имплантации яйцеклетки в
матке при ее оплодотворении.

Биосинтез значительных количеств эстрагенов, а также прогестерона
начинается в период полового созревания, вызывает развитие у самок
вторичных половых признаков и подготавливает репродуктивную систему к
беременности. В случае зачатия уровень прогестерона в биологических
жидкостях животных возрастает. Наряду с желтым телом во время беремен-
ности возникает новый стероидпродуцирующий орган - плацента. При имп-
лантации оплодотворенной яйцеклетки зстрагены совместно с прогестеро-
ном обеспечивают сохранение беременности.

К концу беременности синтез прогестерона в желтом теле снижается,
но увеличивается роль прогестерона плаценты; уровень его в крови сох-
раняется повышенным до родов, а иногда и после них, задерживая наступ-
ление первой стадии возбуждения полового цикла после рождения потомс-
тва .

Будучи видонеспецифичным гормоном, прогестерон играет одну и ту
же роль у всех видов млекопитающих - травоядных, плотоядных и всеядных
(в том числе у человека). Поэтому, по его уровню можно судить о нас-
туплении беременности, выявлять такие функциональные нарушения яични-
ков, как гипофункция, кисты, персистирующее желтое тело, при которых
самок необходимо лечить.

Учитывая важную роль прогестерона в репродуктивной способности
животных, необходим эффективный и высокопроизводительный метод рутин-
ного контроля за его содержанием в биологических жидкостях (кровь, мо-
локо) животных. Кроме того, в ряде случаев, особенно, у мелких млеко-
питающих целесообразно определение прогестерона в слюне, поскольку до-
казана кореляция содержания стероидных гормонов в сыворотке крови и
слюне.

Выпускаемые для нужд медицины иммунохммические наборы для коли-
чественного определения прогестерона непригодны для его определения у
животных.

Разработанный набор реагентов предназначен для количественного
определения прогестерона в биологических жидкостях животных методом
иммуноферментного анализа.

В основе количественного определения прогестерона в биологических
жидкостях животных лежит конкурентный вариант твердофазного иммунофер-
ментного анализа. Принцип метода основан на конкуренции между адсорби-
рованным на поверхности лунок планшета прогестероном и свободным (в
калибровочной пробе или анализируемом образце) прогестероном за актив-
ные центры связывания аффинных антител к прогестерону, меченых перок-
смдазой. В результате иммуноспецифической реакции между антителами к
прогестерону и самим прогестероном, содержащимся в пробах (стандарты
или образцы) и на поверхности лунок планшета образуются комплексы ан-
титела-прогестерон. Комплекс антиген-антитело, не связанный с поверх-
ностью планшета, удаляют путем промывки.

В результате ферментативной реакции пероксидазы с перекисью водо-
рода субстратного раствора происходит окрашивание 3,3',5,5'- тетраме-
тилбензидина (ТМБ) в синий цвет. Интенсивность окраски обратно пропор-
циональна содержанию прогестерона в анализируемом образце. Реакцию ос-
танавливают добавлением серной кислоты, вызывающей смену окраски с си-
ней на ярко желтую. Результаты реакции оцениваются на спектрофотометре
вертикального сканирования при длине волны 450 нм.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

2.1. Набор расчитан на проведение анализа (6 калибровочных проб и
42 неизвестных проб в дубликатах на каждом планшете).

2.2.Состав набора:

1.Планшет 96-луночный с адсорбированным антигеном - 1(2)шт

2.Калиброванные стандарты прогестерона (бесцветная мли
желтоватая прозрачная жидкость по 0,5 мл):

а) Стандарт 0 нМ/л - 1 Фл.

б) Стандарт 1,0 нМ/л - 1 Фл.

в) Стандарт 3,0 нМ/л - 1 Фл.

г) Стандарт 10,0 нМ/л - 1 фл.

д) Стандарт 30,0 нМ/л - 1 фл.

е) Стандарт 100,0 нМ/л - 1 фл.

3. Конъюгат аффинных антител к прогестерону и - 1 фл.
пероксидазы из корня хрена ( жидкость красного или
желтоватого цвета - 1,5 или 3 мл)

4. Растворитель для анализируемых проб - 1 фл.
(бесцветная прозрачная жидкость - 5 или 10 мл)

5. Буфер для анализа n 1 ( жидкость красного или - 1 фл.
желтоватого цвета - 3 или 6 мл)

6. Буфер для анализа n 2 ( жидкость красного или - 1 фл
желтоватого цвета - 1,5 или 3 мл)

7. ФСБР - фосфатно-солевой буферный раствор с - 1 фл.
детергентом, 20-кратный концентрат (бесцветная прозрачная
жидкость - 25 или 50 мл)

8. 3,3',5,5'- тетраметилбензидин (ТМВ) - 1 фл.
(прозрачная жидкость голубоватого цвета -2,2 или 4,4 мл)

9. Субстратный раствор (бесцветная прозрачная жидкость - - 1 фл.
8,8 или 17,6 мл)

10. Стоп-реагент (серная кислота, 2н) - 1 фл.
(бесцветная прозрачная жидкость - 11 или 22 мл)

2.3.Маркировка.

2.3.1. На каждый флакон с компонентом должна быть наклеена эти-
кетка с указанием: наименования предприятия-изготовителя и его товар-
ного знака, названия набора, названия реагента, способа подготовки к
работе ( для отдельных компонентов), условий хранения, срока годности,
номера серии, объема реагента, надписи "Только для "ин витро" диагнос-
тики" , содержания прогестерона (для калиброванных стандартов и раство-
ров) .

2.3.2. На каждую коробку должна быть наклеена этикетка с указани-
ем: наименования предприятия-изготовителя и его товарного знака, наз-
вания набора, состава набора, надписи "Только для "нн вмтро" диагнос-
тики", условий хранения, срока годности, номера серии, номера настоя-
щих технических условий. В коробку вкладывают наставление по примене-
нию .

3.ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ

3.1. Транспортирование наборов производят в соответствии с ОСТ
08064-19-07 всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 8°С
Допускается транспортирование наборов при температуре до 25° С в тече-
ние 1 сут.

3.2. Наборы хранят при температуре от 2 до 8°С в течении всего
срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25° С
не более 1 сут.

3.3. Срок годности набора - 6 мес. со дня изготовления.
Датой изготовления набора считают дату его комплектации.

4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

4.1. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые
или пластиковые перчатки, так как исследуемый материал является потен-
циально инфицированным, способным длительное время сохранять и переда-
вать бактериальные или вирусные инфекции.

4.2. Химическая посуда и оборудование, которые используются в ра-
боте с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и хра-
ниться отдельно.

4.3. Запрещается прием пищи, использование косметических средств
и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

5. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

5.1. ПРОМЫВОЧНЫЙ БУФЕР

Перед использованием добейтесь полного растворения солей фосфат-
но-солевого буферного раствора (ФСБР) путем прогревания флакона в го-
рячей воде. Смешайте необходимое для работы количество ФСБР с дистил-
лированной водой в следующей пропорции: 1 часть ФСВР + 19 частей дис-
тиллированной воды. Неиспользованный ФСБР храните при 4° С.

5.2. КОНЪЮГАТ

Рабочий раствор Конъюгата готовится непосредственно перед исполь-
зованием и хранению, в отличие от исходного раствора, не подлежит. Для
работы на целом планшете требуется 5 мл рабочего раствора Конъюгата.
В зависимости от количества анализируемых проб, смешайте Буфер для
анализа n1, Буфер для анализа n2 и Конъюгат в соотношении 2:1:1. Ос-
тавшиеся не использованными исходные растворы Конъюгата и Буфера для
анализа n1 и n2 храните при + 4° С.

5.3. СТАНДАРТЫ

Перед использованием стандарты и растворитель для анализируемых проб
следует прогреть для размораживания растворителя. Чистыми наконечника-
ми перенесите по 60 мкл каждого стандарта в предварительно маркирован-
ные флаконы и добавьте по 390 мкл Промывочного буфера, перемешайте и
используйте в ИФА. Исходные растворы храните при +4° С.

5.4. ХРОМОГЕН

Смешайте содержимое флаконов ТМБ и субстратного раствора в соотно-
шении: 1 часть раствора ТМБ и 4 части субстратного раствора, переме-
шайте. Для работы с растворами хромогена необходимо использовать только
чистую посуду и чистые наконечники.(Раствор готовится непосредственно
перед употреблением). Оставшиеся неиспользованными растворы храните
при + 4°С.

6.ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Образцы биологических жидкостей, если они не исследуются в тот же
день, должны быть заморожены и храниться при - 20° С.

Перед проведением экстракции образцы должны быть прогреты в тече-
ние 30 минут при 60° С.

Все работы по экстракции исследуемых образцов необходимо прово-
дить в вытяжном шкафу.

Для анализа прогестерона у особей мужского пола требуется больший
объем исследуемого материала, чем для особей женского пола.

6.1. Слюна особей женского пола

- отберите по 1,0 мл слюны в стеклянные или полиэтиленовые про-
бирки. Добавьте по 3,0 мл дизтилового эфира, закройте пробирки пробка-
ми, интенсивно перетрясите в течение 1 минуты и поместите в емкость,
содержащую смесь ацетона и сухого льда до замораживания водной фазы (
замораживание водной фазы можно проводить в холодильнике при -20° С и
ниже в течение 30 минут);

- перелейте эфирный экстракт во флаконы или пробирки и поместите
их на водяную баню при +37° С до полного выпаривания эфира;

- растворите сухой остаток в 50 мкл Растворителя для анализируе-
мых проб, добавьте 325 мкл рабочего раствора Промывочного буфера и ис-
пользуйте в ИФА (до использования храните при -20° С).

6.2. Сыворотка, плазма особей женского пола.

- отберите по 0,2 мл сыворотки или плазмы в стеклянные или полиз-
гиленовые пробирки. Добавьте по 1 мл дизтилового эфира, закройте про-
бирки пробками, интенсивно перетрясите в течение 1 минуты и поместите
в емкость, содержащую смесь ацетона и сухого льда до замораживания
водной фазы С замораживание водной фазы можно проводить в холодильнике
при -20° С и ниже);

- перелейте эфирный экстракт во флаконы или пробирки и поместите
их на водяную баню при +ЗТ° С до полного выпаривания эфира;

6.3. Сыворотка, плазма особей мужского пола.

- отберите по 1,0 мл сыворотки или плазмы в стеклянные или полиэ-
тиленовые пробирки. Добавьте по 3 мл дизтилового эфира, закройте про-
бирки пробками, интенсивно перетрясите в течение 1 минуты и поместите
в емкость, содержащую смесь ацетона и сухого льда- до замораживания
водной фазы ( замораживание водной фазы можно проводить в холодильнике
при -20° С и ниже);

- растворите сухой остаток в 50 мкл Растворителя для анализируе-
мых проб, добавьте 325 мкл рабочего раствора. Промывочного буфера и ис-
пользуйте в ИФА (до использования храните при -20°гр. С).

7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

7.1. Порядок маркировки планшета и внесения образцов приведен на
схеме. Время внесения образцов в лунки одного планшета не должно пре-
вышать 15 мин.

7.2. Вскрыть упаковку со стрипами (с планшетом) и внести во все
используемые для работы лунки по 300 мкл Промывочного буфера .

7.3. Удалите содержимое переворачиванием планшета или отсасывани-
ем так, чтобы а лунке не осталось жидкости.

7.4. В лунки 1,2 ряда А внести по 150 мкл калибровочной пробы,
содержащей Стандарт О нМ/л.

7.5. В лунки 1,2 ряда В внести по 150 мкл калибровочной пробы,
содержащей Стандарт 1,0 нМ/мл.

7.6. В лунки 1,2 ряда С внести по 150 мкл калибровочной пробы,
содержащей Стандарт 3,0 нМ/л.

7.7. В лунки 1,2 ряда d внести по 150 мкл калибровочной пробы,
содержащей Стандарт 10,0 нМ/л.

7.8. В лунки 1,2 ряда Е внести по 150 мкл калибровочной пробы,
содержащей Стандарт 30,0 нМ/л.

7.9. В лунки 1,2 ряда f внести по 150 мкл калибровочной пробы,
содержащей Стандарт 100,0 нМ/л.

7.10. В остальные лунки внесите по 150 мкл анализируемых образцов
в дубликатах.

7.11. Во все используемые лунки планшета к растворам стандартов и
анализируемых проб прилить по 50 мкл раствора Конъюгата.

7.12. Планшет закрыть крышкой или клеющей бумагой и инкубировать
планшет в течение 30 минут в вибротермостате при температуре +20
+26° С.

СХЕМА ВНЕСЕНИЯ ОБРАЗЦОВ

1 2 3 4

А Стандарт 0 Стандарт 0 Х2 Х2
В Стандарт 1,0 Стандарт 1,0 ХЗ ХЗ
С Стандарт 3,0 Стандарт 3,0 Х4 Х4
d Стандарт 10,0 Стандарт 10,0 Х5 Х5
Е Стандарт 30,0 Стандарт 30,0 Х6 Х6
f Стандарт 100,0 Стандарт 100,0 x7 Х7
g x1 x1 Х8 Х8
Н Х2 Х2 x. . . x. . .

и т.д.

7.13. После окончания времени инкубации жидкость из лунок удалить
переворачиванием планшета или отсасыванием. Немедленно внести во все
лунки планшета по 300 мкл Промывочного буфера,после чего жидкость из
лунок вновь немедленно удалить переворачиванием планшета или отсасыва-
нием.

7.14. Во все используемые лунки планшета внести по 100 мкл раст-
вора Хромогена и инкубировать в течении 7-15 минут при температуре
+37° С в термостате.

7.15. Во все используемые лунки планшета к раствору Хромогена до-
бавить по 100 мкл Стоп-реагента для остановки ферментативной реакции.
Окраска стабильна в течении 30 минут.

7.16. Измерить оптическую плотность (ОП) всех лунок планшета на
фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм не позднее
30 минут после остановки ферментативной реакции.

8. РАСЧЕТЫ И ГРАФИЧЕСКИЕ ПОСТРОЕНИЯ

Оптическую плотность (ОП) субстратного раствора после остановки
ферментативной реакции измеряют на спектрофотометре типа "Униплан"
или "Унискан" при длине волны 450 нм. Программное обеспечение прибора
позволяет получать результаты измерений в виде графического построения
калибровочной кривой и конечных концентраций прогестерона в анализиру-
емых образцах. При использовании приборов с отсутствием программного
обеспечения обработки результатов, необходимо провести графические
построения и расчеты концентраций прогестерона вручную. Для этого не-
обходимо:

а) Вычислить среднее арифметическое значение ОП лунок, содержащих
одни и те же стандарты или пробы: 1А и 2А у 1В и 2В;1С и 2С и т.д.

б) Разделить полученные значения ОП калиброванных стандартов и
неизвестных проб ( Вх ) на полученное значение ОП в О стандарте (Во)
и умножить полученные величины на 100% .

в) Построение калибровочной кривой.

Калибровочную кривую строят на полулогарифмической бумаге, откла-
дывая по оси абсцисс (логарифмическая ) концентрации прогестерона
(нМ/л), а по оси ординат (линейная) - полученные значения Вх /Во х
100% в калибровочных стандартах. Для определения содержания прогесте-
рона, в исследуемой пробе необходимо расчитать величину Вх/Во х100%
для данной пробы и по калибровочной кривой установить концентрацию
прогестерона.

Типичная калибровочная кривая, полученная с использованием набора
ИфА-АФ-Прог. представлена на рис.

г). Расчет конечной концентрации гормона (К) проводится с учетом
объемов анализируемого образца до экстракции и используемого для ана-
лиза в ИФА (150 мкл):

- слюна женских особей: полученный в ИФА результат (в нМ/л)
разделите на 20;

- сыворотка, плазма мужских особей:полученный в ИФА резуль-
тат (в нМ/л) разделите на 20;

- сыворотка, плазма женских особей:полученный в ИФА резуль-
тат (в нМ/л) разделите на 4 ;

9. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

9.1. Диапазон измеряемого содержания общего прогестерона составляет
1,0 - 100,0 нМ/мл.

9.2. Специфичность анализа. Перекрестная реакция антисыворотки к
прогестерону со структурно-родственными стероидами приведена в таблице

Таблица

Стероид Перекрестная реакция ,%

Прогестерон 100
11а-Гидроксипрогестерон 1,2
17в-Гидроксипрогестерон 3,5
Эстрадиол <0,01
Эстрон <0,01
Эстриол <0,01
Кортиэол- <0,01
Тестостерон <0,01
5а-Прегнан 3.20 дион 6,7
Прегненолон 2,1

9.3. Минимальное содержание прогестерона, определяемое с помощью
набора ИфА-АФ-Прог., составляет 0,5 нмоль/л.

9.4. Тест на "линейность". Зависимость содержания прогестерона от
разведения калибровочных проб находится в диапазоне 85-115 %.

9.5. Воспроизводимость результатов. Коэффициент вариации резуль-
татов измерения содержания прогестерона в образцах,полученных с по-
мощью набора ИфА-АФ-Прог., не превышает 12 %.

9.6. Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора
ИФА-АФ-Прог.уточнить значения содержания прогестерона, соответствующие
нормальным.

10. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ТЕСТА

Определение концентраций прогестерона в биологических жидкостях
животных позволяет:

- выявить патологии половых органов;

- подтвердить половую охоту и овуляцию;

- определить фертильность в ранние сроки.

Уровень прогестерона в биологических жидкостях самок подвержен
циклическим, а у некоторых животных (псовые, куньи и др.) и сезонным
изменениям.

У большинства млекопитающих в фолликулярную фазу концентрация
прогестерона в сыворотке (плазме) крови не превышает 10 нМ/л. В лютей-
новую фазу уровень прогестерона в 3-10 раз выше, чем в фолликулярную
фазу. Определение прогестерона в биологических жидкостях позволяет вы-
явить такие функциональные нарушения яичников, как гипофункция, кисты,
персистентное желтое тело, при которых самок необходимо лечить. У жи-
вотных с фолликулярными кистами отсутствует желтое тело, основным гор-
моном которого является прогестерон. Поэтому у таких животных наблюда-
ется постоянно низкая концентрация прогестерона и в лютеиновую фазу
полового цикла, когда в норме происходит прогрессивное возрастание
концентрации прогестерона у нормально циклирующих самок, содержание
его у бесплодных животных не превышает базального уровня. При лютеино-
вой кисте отмечают постоянно повышенный уровень прогестерона, незначи-
тельно меньший, чем при функционирующем желтом тепе. После проведения
соответствующего лечения путем исследования концентрации прогестерона
можно проконтролировать восстановление репродуктивной функции у самок.

Определением прогестерона во время половой охоты можно устано-
вить, в оптимальные ли сроки проведено осеменение самки. Низкое содер-
жание прогестерона свидетельствует о наличии фолликуля в яичнике, а
возрастание его - об образовании желтого тела, когда овуляция прошла.

Снижение концентраций прогестерона в биологических жидкостях
жвачных и лошадей начинается за 2-4 дня, а у свиней - за 6-7 дней до
начала "охоты", у куньих в период подготовки к спариванию наблюдается
кратковременное повышение уровня прогестерона в крови, совпадающее со
временем созревания фолликулов.

Определение концентраций прогестерона в биологических жидкостях
в настоящее время является основным диагностическим тестом для раннего
выявления плодотворного осеменения и фертильности животных. В случае
зачатия уровень прогестерона остается высоким и не снижается к началу
следующего полового цикла.

11. ПОРЯДОК ПРЕДСТАВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

Рекламации на наборы реагентов для количественного определения
тестостерона в биологических жидкостях животных методом иммунофермент-
ного анализа направляют во Всероссийский государственный научно-иссле-
довательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветери-
нарных препаратов (ВГНКИ) (123022, г. Москва, Д-22, Звенигородское
шоссе д.5), предприятию-изготовителю и в Центральную научно-методичес-
кую лабораторию (ЦНМВЛ) (111622,г. Москва, улица Оранжерейная, дом 23)
в соответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России n 22-7/28 от
08.05.92 г. " 0 порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты оте-
чественного производства и закупаемые по импорту"; одновременно с рек-
ламацией в адрес ВГНКИ направляют одну тест-систему.

Наставление разработано:

ТОО "М.А.В." (Н.Г. Матрешина, А.В. Матрешин), МГАВМиБ им. К.И. Скря-
бина (Н.П. Лысенко.)