МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

17.08.98г. № 13-7-2 /i355

ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора реагентов для
количественного определения эстра-
диола в биологических жидкостях жи-
вотных методом иммуноферментного
анализа ( ИФА-АФ-ЭСТР.)

(В порядке широкого производствен-
ного испытания на 1000 000 исследо-
ваний до 2001 года)

1. НАЗНАЧЕНИЕ

К половым гормонам самок относятся эстрадиол, эстриол и эстрон (эстрагены), а также прогестерон. Самым активным из эстрагенов является зстрадиол, который в 10 раз активнее эстрона и в 50 раз - эстриола.

Ведущая роль в биосинтезе эстрагенов в отсутствие беременности принадлежит яичникам. Биосинтез эстрагенов в яичнике представляет собой циклический процесс. В первую фазу полового цикла (рост фолликулов) основными стероидами, секретируемыми яичниками являются эстрагены. Во вторую фазу (рост и развитие желтого тела) доминирует секреция прогестерона. Во время беременности возникает новый стероидпродуцирующий орган ~ плацента. Биосинтез значительных количеств эстрагенов, а также прогестерона начинается в период полового созревания, вызывает развитие у самок вторичных половых признаков и подготавливает репродуктивную систему к беременности. Эстрагенам принадлежит ведущая роль в цитодифференциации яйцеводов млекопитающих. Эти гормоны ведут к созданию в них оптимальных условий для транспорта яйцеклетки и ее оплодотворения. При имплантации оплодотворенной яйцеклетки эстрагены совместно с прогестероном обеспечивают сохранение беременности.

Учитывая ключевую роль эстрагенов в репродуктивной способности животных, необходим эффективный и высокопроизводительный метод рутинного контроля за содержанием эстрадиола в биологических жидкостях (кровь, молоко) животных. Кроме того, в ряде случаев, особенно, у мелких млекопитающих целесообразно определение эстрадиола в слюне, поскольку доказана кореляция содержания стерондных гормонов в сыворотке крови и слюне.

Выпускаемые для нужд медицины иммунохимические наборы для количественного определения эстрадиола непригодны для его определения у животных.

Разработанный набор реагентов предназначен для количественного определения эстрадиола в биологических жидкостях животных методом иммуноферментного анализа.

В основе количественного определения эстрадиола в биологических жидкостях животных лежит конкурентный вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Принцип метода основан на конкуренции между адсорбированным на поверхности лунок планшета эстрадиолом м свободным (в калибровочной пробе или анализируемом образце) эстрадиолом за активные центры связывания аффинных антител к эстрадиолу, меченых пероксидазой. В результате иммуноспецифической реакции между антителами к эстрадиолу и самим эстрадиолом, содержащимся в пробах (стандарты или образцы) и на поверхности лунок планшета образуются комплексы антитела-зстрадиол. Комплекс антиген-антитело, не связанный с поверхностью планшета, удаляют путем промывки.

В результате ферментативной реакции пероксидазы с перекисью водорода субстратного раствора происходит окрашивание 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в синий цвет. Интенсивность окраски обратно пропорциональна содержанию эстрадиола в анализируемом образце. Реакцию останавливают добавлением серной кислоты, вызывающей смену окраски с синей на ярко желтую. Результаты реакции оцениваются на спектрофотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА

2.1.Набор рассчитан на проведение анализа(6 калибровочных проб и 42 неизвестных проб в дубликатах на каждом планшете).

2.2.Состав набора:

1.Планшет 96-луночный с адсорбированным антигеном 1(2)шт.

2.Калиброванные стандарты эстрадиола (бесцветная или желтоватая прозрачная жидкость по 0,5 мл):

а) Стандарт О нМ/л 1фл.

б) Стандарт 0,1 нМ/л 1фл.

в) Стандарт 0,3 нМ/л 1фл.

г) Стандарт 1,0 нМ/л 1фл.

д) Стандарт 3,0 нМ/л 1Фл.

е)Стандарт10,0нМ/л 1 фл.

3. Конъюгат аффинных антител к эстрадиолу и 1 фл.

пероксидазы из корня хрена (жидкость красного или

желтоватого цвета - 1,5 или 3 мл)

4. Растворитель для анализируемых проб 1 фл. (бесцветная прозрачная жидкость - 5 или 10 мл)
5. Буфер для анализа n 1 ( жидкость красного или 1 фл.

желтоватого цвета - 3 или 6 мл)

6. Буфер для анализа n 2 ( жидкость красного или 1 фл. желтоватого цвета - 1,5 или 3 мл)

7. ФСБР - фосфатно-солевой буферный раствор с 1 фл. детергентом, 20-кратный концентрат (бесцветная прозрачная жидкость - 25 или 50 мл)

8. 3,3',5,5'- тетраметилбензидин (ТМВ) 1 фл. (прозрачная жидкость голубоватого цвета -2,2 или 4,4 мл)

9. Субстратный раствор (бесцветная прозрачная жидкость - 1 фл. 8,8 или 17,6 мл)
10. Стоп-реагент (серная кислота, 2н) 1 фл. (бесцветная прозрачная жидкость - 11 или 22 мл) 2.3.Маркировка.

2.3.1. На каждый флакон с компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием: наименования предприятия-изготовителя и его товарного знака, названия набора, названия реагента, способа подготовки к работе ( для отдельных компонентов), условий хранения, срока годности, номера серии, объема реагента, надписи "Только для "ин витро" диагностики" , содержания эстраднола (для калиброванных стандартов и растворов) .

2.3.2. На каждую коробку должна быть наклеена этикетка с указанием: наименования предприятия-изготовителя и его товарного знака, названия набора, состава набора, надписи "Только для "ин витро" диагностики", условий хранения, срока годности, номера серии, номера настоящих технических условий. В коробку вкладывают наставление по применению .

3.ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ

3.1. Транспортирование наборов производят в соответствии с ОСТ 08064-19-07 всеми видами крытого транспорта при температуре от 2 до 8гр.С Допускается транспортирование наборов при температуре до 25гр. С в течение 1 сут .

3.2. Наборы хранят при температуре от 2 до 8 гр.С в течении всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25°С не более 1 сут.

3.3. Срок годности набора - 6 мес. со дня изготовления. Датой изготовления набора считают дату его комплектации.

4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

4.1. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как исследуемый материал является потенциально инфицированным, способным длительное время сохранять и передавать бактериальные или вирусные инфекции.4.2. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.

4.3. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.

5. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

5.1. ПРОМЫВОЧНЫЙ БУФЕР

Перед использованием добейтесь полного растворения солей фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) путем прогревания флакона в горячей воде. Смешайте необходимое для работы количество ФСБР с дистиллированной водой в следующей пропорции: 1 часть ФСБР + 19 частей дистиллированной воды. Неиспользованный ФСБР храните при 4° С.

5.2. КОНЪЮГАТ

Рабочий раствор Конъюгата готовится непосредственно перед использованием и хранению, в отличие от исходного раствора, не подлежит. Для работы на целом планшете требуется 5 мл рабочего раствора Конъюгата. В зависимости от количества анализируемых проб, смешайте Буфер для анализа n1, Буфер для анализа n2 и Конъюгат в соотношении 2:1:1. Оставшиеся не использованными исходные растворы Конъюгата и Буфера для анализа n1 и n2 храните при + 4° С.

5.3. СТАНДАРТЫ

Перед использованием стандарты и растворитель для анализируемых проб следует прогреть для размораживания растворителя. Чистыми наконечниками перенесите по 60 мкл каждого стандарта в предварительно маркированные флаконы и добавьте по 390 мкл Промывочного буфера, перемешайте и используйте в ИФА. Исходные растворы храните при +4° С.

5.4. ХРОМОГЕН

Смешайте содержимое флаконов ТМБ и субстратного раствора в соотношении: 1 часть раствора ТМБ и 4 части субстратного раствора, перемешайте. Для работы с растворами хромогена необходимо использовать только чистую посуду и чистые наконечники. (Раствор готовится непосредственно перед употреблением).Оставшиеся неиспользованными растворы храните при + 4°С.

Образцы биологических жидкостей, если они не исследуются в тот же день, должны быть заморожены и храниться при - 20° С.

Все работы по экстракции исследуемых образцов необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Для анализа эстрадиола у особей мужского пола требуется больший объем исследуемого материала, чем для особей женского пола.

- отберите по 1,0 мл слюны в стеклянные или полиэтиленовые пробирки. Добавьте по 3,0 мл диэтилового эфира, закройте пробирки пробками, интенсивно перетрясите в течение 1 минуты и поместите в емкость, содержащую смесь ацетона и сухого льда до замораживания водной фазы (замораживание водной фазы можно проводить в холодильнике при -20° С и ниже в течение 30 минут);

- перелейте эфирный экстракт во флаконы или пробирки и поместите их на водяную баню при +37° С до полного выпаривания эфира;

растворите сухой остаток в 50 мкл Растворителя для анализируемых проб, добавьте 325 мкп рабочего раствора Промывочного буфера и используйте в ИФА (до использования храните при -20° С).

6.2. Сыворотка, плазма особей женского пола.

- отберите по 0,2 мл сыворотки или плазмы в стеклянные или полиэтиленовые пробирки. Добавьте по 1 мл дизтилового эфира, закройте пробирки пробками, интенсивно перетрясите в течение 1 минуты и поместите в емкость, содержащую смесь ацетона и сухого льда до замораживания водной фазы(заморажи-вание водной фазы можно проводить в холодильнике при -20° С и ниже);

-перелейте эфирный экстракт во флаконы или пробирки и поместите их на водяную баню при +37° С до полного выпарива-

- растворите сухой остаток в 50 мкл Растворителя для анализируемых проб, добавьте 325 мкл рабочего раствора Промывочного буфера и используйте в ИФА (до использования храните при -20° С.

- отберите по 1,0 мл сыворотки или плазмы в стеклянные или полиэтиленовые пробирки. Добавьте по 3 мл диэтилового эфира, закройте пробирки пробками, интенсивно перетрясите в течение 1 минуты и поместите в емкость, содержащую смесь ацетона и сухого льда до замораживания водной фазы заморажи-вание водной фазы можно проводить в холодильнике при -20° С и ниже);

- перелейте эфирный экстракт во флаконы или пробирки и поместите их на водяную баню при +37° С до полного выпарива-

ния эфира;

- растворите сухой остаток в 50 мкл Растворителя для анализируемых проб, добавьте 325 мкл рабочего раствора Промывочного буфера и используйте в ИФА (до использования храните при -20° С).

7.1 . Порядок маркировки планшета и внесения образцов приведен на схеме. Время внесения образцов в лунки одного планшета не должно превышать 15 мин.

7.2. Вскрыть упаковку со стрипами (с планшетом) и внести во все используемые для работы лунки по 300 мкл Промывочного буфера.

7.3. Удалите содержимое переворачиванием планшета или отсасыванием так, чтобы в лунке не осталось жидкости.

1. В лунки 1,2 ряда А внести по150 мкл калибровочной пробы,содержащей

7.5. В лунки 1,2 ряда В внести по 150 мкл калибровочной пробы, содержащей Стандарт 0,1 нМ/мл.

7.6. В лунки 1,2 ряда С внести по 150 мкл калибровочной пробы, содержащей Стандарт 0,3 нМ/л.

7.7. В лунки 1,2 ряда d внести по 150 мкл калибровочной пробы, содержащей Стандарт 1,0 нМ/л.

7.8. В лунки 1,2 ряда Е внести по 150 мкл калибровочной пробы, содержащей Стандарт 3,0 нМ/л.

7.9. В лунки 1,2 ряда f внести по 150 мкл калибровочной пробы, содержащей Стандарт 10,0 нМ/л.

7.10. В остальные лунки внесите по 150 мкл анализируемых образцов в дубликатах.

7.11. Во все используемые лунки планшета к растворам стандартов и анализируемых проб прилить по 50 мкл раствора Конъюгата.

7.12. Планшет закрыть крышкой или клеящей бумагой и инкубировать планшет в течение 30 минут в вибротермостате при комнатной температуре (+20 -+26° С).

7.13. После окончания времени инкубации жидкость из лунок удалить переворачиванием планшета или отсасыванием. Немедленно внести во все лунки планшета по 300 мкл Промывочного буфера, после чего жидкость из лунок вновь немедленно удалить переворачиванием планшета или отсасыванием.

7.14. Во все используемые лунки планшета внести по 100 мкл раствора Хромогена и инкубировать в течении 7-15 минут при температуре +37° С в термостате.

7.15. Во все используемые лунки планшета к раствору Хромогена добавить по 100 мкл Стоп-реагента для остановки ферментативной реакции. Окраска стабильна в течении 3О минут.

7.16. Измерить оптическую плотность (ОП) всех лунок планшета на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм не позднее 30 минут после остановки ферментативной реакции. .

СХЕМА ВНЕСЕНИЯ ОБРАЗЦОВ

и т.д.

8. РАСЧЕТЫ И ГРАФИЧЕСКИЕ ПОСТРОЕНИЯ

Оптическую плотность (ОП) субстратного раствора после остановки ферментативной реакции измеряют на спектрофотометре типа "Униплан" или "Унискан" при длине волны 450 нм. Программное обеспечение прибора позволяет получать результаты измерений в виде графического построения калибровочной кривой и конечных концентраций эстрадиола в анализируемых образцах. При использовании приборов с отсутствием программного обеспечения обработки результатов, необходимо провести графические построения и расчеты концентраций эстрадиола вручную. Для этого необходимо:

а) Вычислить среднее арифметическое значение ОП лунок, содержащих одни и те же стандарты или пробы: 1А и 2А ;1В и 2В;1С и 2С и т.д.

б) Разделить полученные значения ОП калиброванных стандартов и неизвестных проб ( Вх ) на полученное значение ОП в О стандарте ( Во) и умножить полученные величины на 100% .

в) Построение калибровочной кривой.

Калибровочную кривую строят на полулогарифмической бумаге, откладывая по оси абсцисс (логарифмическая ) концентрации эстрадиола (нМ/л), а по оси ординат (линейная) - полученные значения Вх /Во х 100% в калибровочных стандартах. Для определения содержания эстрадиола, в исследуемой пробе необходимо рассчитать величину Вх/Во х100% для данной пробы и по калибровочной кривой установить концентрацию зстрадиола. Типичная калибровочная кривая, полученная с использованием набора ИФА-Аф-Эстр. представлена на рис.

г). Расчет конечной концентрации гормона (К) проводится с учетом объемов анализируемого образца до экстракции и используемого для анализа в ИФА (150 мкл):

9.1. Диапазон измеряемого содержания эстрадиола составляет 0,1- 10,0 нМ/л.

9.2. Специфичность анализа. Перекрестная реакция антисыворотки к эстрадиолу со структурно-родственными стероидами приведена в таблице.

Таблица 2

9.3. Минимальное содержание эстрадиола, определяемое с помощью набора ИфА-Аф-Эстр., составляет 0,06 нМ/л.

9.4. Тест на "линейность". Зависимость содержания эстрадиола от разведения калибровочных проб находится в диапазоне 85-115 %.

9.5. Воспроизводимость результатов. Коэффициент вариации результатов измерения содержания эстрадиола в образцах, полученных с помощью набора ИфА-Аф-Эстр., не превышает 12 %.

9.6. Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора ИфА-Аф-Эстр. уточнить значения содержания эстрадиола, соответствующие нормальным.

Содержание эстрадиола в сыворотке (плазме) самок не превышает 0,3-0,5 нМ/л на начальном этапе созревания фолликула и резко возрастает, когда созревание фолликула завершается, достигая 1-2 нМ/л. В лютеиновую фазу уровень эстрадиола в 2-5 раз ниже, чем на стадии зрелого Фолликула. Поэтому определение эстрадиола в сыворотке (плазме) крови позволяет выявить такие функциональные нарушения яичников, как гипофункция, кисты, при которых самок необходимо лечить. У животных с фолликулярными кистами отсутствует желтое тело, а концентрация эстрадиола в сыворотке крови достигает значений, характерных для овуляторного пика. У кур-несушек отмечается постоянно высокий уровень эстрадиола в сыворотке крови - 1,5-2 нМ/л. У собачьих и куньих наблюдаются сезонные колебания эстрадиола с максимумом в период гона. В фолликулярную фазу полового цикла, когда в норме происходит прогрессивное возрастание концентрации эстрадиола у нормально циклирующих самок, содержание его у бесплодных животных не повышается и не превышает базального уровня. После проведения соответствующего лечения путем исследования концентрации эстрадиола можно проконтролировать восстановление репродуктивной Функции у самок.

11. ПОРЯДОК ПРЕДСТАВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

Рекламации на наборы реагентов для количественного определения эстрадиола в биологических жидкостях животных методом иммуноферментного анализа направляют во Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) (123022, г. Москва, Д-22, Звенигородское шоссе, д.5), предприятию-изготовителю и в Центральную научно-методическую лабораторию (ЦНМВЛ) (111622,г. Москва, улица Оранжерейная, дом 23) в соответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России n 22-7/28 от 08.05.92 г.

“О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту”; одновременно с рекламацией в адрес ВГНКИ направляют одну тест-систему.

Наставление разработано:

ТОО "М.А.В." (Н.Г.Матрешина, А.В.Матрешин) н Центральной научно-методической ветеринарной лабораторией (В.А. Седов).