МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
02.11.98г. n 13-7-2/1431
ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора для
выявления антител к вирусу
инфекционного
ларинготрахеита птиц в
сыворотках крови кур
иммуноферментным методом
(в порядке широкого
производственного испытания
в 1998 -2000гг.)
1. Общие положения
1.1 Набор предназначен для выявления антител к вирусу
инфекционного ларинготрахеита птиц в сыворотках крови кур
иммуноферментным методом (ИФА).
1.2 В состав набора входят иммуноспецифические и
неспецифические компоненты.
Иммуноспецифические компоненты: К1 - гипериммунная сыворотка
крови кур к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц
(положительный контроль) цельная лиофилизированная, сухая
мелкопористая масса белого или светло-желтого цвета, 1.0 куб.см - 1
ампула (флакон), К2 - нормальная сыворотка крови кур
(отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу
инфекционного ларинготрахеита птиц, цельная,
лиофилизированная, сухая мелкопористая масса белого или светло-
желтого цвета, 1.0 куб.см - 1 ампула (флакон), КЗ- антиген вируса
инфекционного ларинготрахеита птиц адсорбированный по 0,1 куб.см в
лунках планшета для ИФА - 2 планшета, К4 - антивидовой
иммунопероксидазный конъюгат против igg кур, сухая
мелкопористая масса белого цвета, 0,5 куб.см - 1 ампула,
рабочее разведение 1: 200 (указывается для каждой серии).
Неспецифические компоненты:
К5 - набор солей для приготовления буферного
раствора для испытуемых и контрольных проб, антивидового
конъюгата и межэтапной промывки (порошки белого цвета): трис
(оксиметил) аминометан - 0,97г (К5.1), трис (оксиметил) аминометан
гидрохлорид(трис hci) - 6,61г (К5.2), натрий хлористый - 11,7г
(К5.3), - по 1 флакону;
К6 - набор солей для приготовления субстратного буфера,
(порошки белого цвета); натрий фосфорнокислый двузамещенный
12-водный - 5,37г (К6.1) - 1 флакон, лимонная кислота - 1,57г (К6.2) -
1 флакон,
К7 - детергент-твин-20, вязкая тягучая маслянистая жидкость
соломенно-желтого цвета - 1,0 куб.см - 1 флакон,
К8 - субстра ортофенилендиамин, таблетка сероватого
цвета, 8мг - 1 шт. во флаконе,
К9 - перекись водорода, прозрачная бесцветная жидкость или
гидропирит - таблетка белого цвета, 0.5г - 1 шт. в упаковке.
1.3. Ампулы (флаконы) с компонентами набора этикетируют с
указанием номера флакона, наименования компонента, номера
серии и срока годности.
1.4. Ампулы, флаконы без этикеток, с трещинами, с
измененной консистенцией подлежат выбраковке, обеззараживанию
и утилизации.
1.5. Ампулы (флаконы) с компонентами набора упаковывают в
картонные коробки. На коробки с наборами наклеивают этикетки, в
которых указывают наименование и товарный знак предприятия-
изготовителя, полное название набора, номер серии, номер
госконтроля, дату комплектования набора, условия хранения, срок
годности, обозначение ТУ.
Внутрь каждой коробки набора вкладывают наставление по
применению набора с перечнем комплектующих компонентов и
описанием постановки анализа.
1.6. Срок годности набора 12 мес. со дня изготовления при
хранении в защищенном от света месте и температуре от 2° до 8°С.
1.7. Набор рассчитан на проведение 176 анализов сывороток
крови кур при исследовании в одном разведении 1:400, при
раститровке сывороток двукратным шагом от 1:100 до 1:12800 - на
20 анализов, при раститровке сывороток четырехкратным шагом от
1:100 до 1:12800 - на 200 анализов.
Положительные результаты, полученные при анализе с
применением набора, должны быть подтверждены
вирусологическими исследованиями для решения вопроса о
благополучии птицефермы по инфекционному ларинготрахеиту.
2. Подготовка компонентов набора и оборудования для
проведения исследований
2.1. Для постановки ИФА используют:
одно- и восьмиканальные автоматические пипетки со сменными
наконечниками, термостат с температурой нагрева (37,0 +- 0,5)° С,
бытовой холодильник, рН-метр (тип 121 или 340), спектрофотометр
с вертикальным лучом или ридер любой модели для учета
результатов ИФА.
2.2. Приготовление растворов.
Перед приготовлением рабочих растворов набор с компонентами
выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20)°С.
2.2.1. Раствор №1. Содержимое флаконов К5.1, К5.2 и К5.3
растворяют в 1000 куб.см дистиллированной воды и измеряют
показание рН, которое должно быть в пределах 7,4-7,6.
Затем в этот раствор вносят содержимое флакона К7, получая
конечную концентрацию детергента 0,1%. Данный раствор
используют для разведения контрольных сывороток, испытуемых
проб, антивидового конъюгата и межэтапной промывки. Раствор №1
хранят не более 20 сут. при температуре 4°С.
2.2.2. Раствор №2. Фосфатно-цитратный буфер рН 4,9-5,0. Для
приготовления субстратного буфера содержимое флакона К6.1
растворяют в 50 куб.см дистиллированной воды, содержимое флакона
К6.2 растворяют в другой мерной колбе в 50 куб.см дистиллированной
воды. Затем смешивают 24,3 куб.см раствора К6.1 с 25,7 куб.см раствора
К6.2 и добавляют 50 куб.см дистиллированной воды. Полученный
раствор должен иметь рН 4,9-5,0, при необходимости добавляют
кислый (К6.2) или щелочной (К6.1) компоненты. Раствор №2 хранят
не более 20 суток при температуре 4°С.
2.2.3. Раствор №3. Содержимое флакона К1 растворяют в 0,5
куб.см раствора №1. Готовят перед использованием. Допускается
хранение в течение 3 сут. при 4°С.
2.2.4. Раствор №4. Содержимое флакона К2 с нормальной
сывороткой крови кур растворяют в 0,5 куб.см раствора №1. Раствор
№4 готовят перед использованием, допускается хранение в течение
3 сут. при 4°С.
2.2.5. Раствор №5. Содержимое флакона К4 с антивидовым
конъюгатом растворяют в 0,5 куб.см раствора №1. Для получения
рабочего разведения 1:200 из этого флакона отбирают 50 мкл на
10.0 куб.см раствора №1 (на планшет), рабочее разведение готовят
перед использованием.
2.2.6. Раствор №6. 1 таблетку гидропирита (К9) растворяют в
20,0 куб.см дистиллированной воды.
2.2.7. Раствор №7. Субстратно-индикаторная смесь.
Содержимое флкона К8 (таблетку) растворяют в 20 куб.см раствора
№2, встряхивают до полного растворения и добавляют на каждые 10
куб.см этого раствора по 0.4 куб.см раствора №6. Готовят раствор №7
непосредственно перед использованием.
3. Постановка реакции
3.1. Из комплекта набора берут один планшет (КЗ), в лунках
которого адсорбирован антиген вируса инфекционного
ларинготрахеита птиц и используют для постановки
иммуноферментного анализа.
3.2. Разведение сывороток. Образцы контрольных сывороток и
исследуемых проб сывороток крови разводят 1:400 раствором
№1. С этой целью к 0,0025 куб.см сыворотки крови кур добавляют 1,0
куб.см раствора №1 и перемешивают.
3.3. В лунки планшета от А2-12... до Н2-Н12 включительно
вносят по 0.1 куб.см исследуемых проб сывороток крови. В лунки В1 и
С1 вносят контрольную гипериммунную сыворотку (положительный
контроль), а в d1 и Е1 контрольную неиммунную сыворотку
(отрицательный контроль). Лунки f1 и g1 служат контролем
конъюгата и заполняются по 0,1 куб.см раствора №1.
3.4. Планшет осторожно встряхивают, закрывают крышкой и
переносят в термостат (37 +- 0.5)°c на 2 ч. Затем лунки планшета
освобождают от содержимого путем встряхивания и трехкратно
промывают раствором №1.
3.5. Готовят раствор №5 по п.2.2.5 и вносят во все лунки
планшета по 0,1 куб.см, затем опять помещают в термостат на
(37 +- 0,5)°c на 1 ч и промывают как в п.3.4.
3.6. Готовят раствор №7 по п.2.2.7 и вносят во все лунки по
0,1 куб.см. Оставляют при температуре (20 +- 0,5)°С в темном месте на
5 - 10 мин. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку
0,05 куб.см серной кислоты, приготовленной путем растворения 2
куб.см концентрированной серной кислоты (в наборе отсутствует)
в 10 куб.см дистиллированной воды.
3.7. В случае отсутствия инструментального учёта результатов
реакции оценку специфической активности сывороток
крови можно проводить путем раститровки испытуемых сывороток. В
этом случае во все лунки рядов планшета В1-12... Н1-12 вносят по
0,1 куб.см раствора №1, а в лунки А2-11 вносят по 0,2 куб.см
исследуемых проб сывороток крови в разведении 1:100,
приготовленных следующим образом: к 0,01 куб.см сыворотки крови кур
добавляют 1 куб.см раствора №1 , и проводят раститровку по
вертикальным рядам, начиная с 1:100 до 1:12800. В лунки А2 и А12
вносят разведения 1:100 контрольных (нормальной п.2.2.4 и
положительной п.2.2.3) сывороток и также проводят раститровку по
вертикальным рядам. Из последних лунок Н1-Н12 удаляют по 0,1
куб.см.
3.8. При обнаружении высоких титров антител в испытуемых
пробах проводят раститровку по горизонтальным рядам планшета.
4. Учет результатов реакции.
4.1. Учет результатов анализа проводят после остановки
реакции одним из способов: визуально - по интенсивности
окрашивания содержимого лунок планшета или инструментально - с
помощью спектрофотометра с вертикальным лучом при длине волны
492 нм.
5.0. Оценка и интерпретация результатов.
Использование предлагаемого набора позволяет:
- Дифференцировать испытуемые сыворотки на категории
положительно- или отрицательно реагирующие.
- Определить титр испытуемой положительно реагирующей
сыворотки.
5.1. Дифференциация сывороток (качественная оценка).
а) Визуальная оценка.
Учет результатов проводят путем сравнения интенсивности
окраски испытуемой пробы относительно положительного и
отрицательного контроля. Лунки с положительным контролем
окрашиваются в желтый цвет различной интенсивности. В лунках с
отрицательным контролем раствор незначительно желтеет или
остается неокрашенным. Если интенсивность окраски испытуемой
пробы соответствует положительному контролю - проба
положительная, если отрицательному - проба отрицательная. За
титр испытуемой сыворотки принимают последнее разведение ее,
при котором наблюдают видимое цветовое окрашивание, более
интенсивна по сравнению с отрицательным контролем.
б) Инструментальная оценка.
Реакцию контролируют по отношению значений оптической
плотности положительного контроля (лунки А1 и В1) к значениям
отической плотности отрицательного контроля (лунки С1 и d1) по
каждому планшету;
Пример:
А1+В1 1.354+1.456
----- = ------------- = 9.68 ;
c1+d1 0.135+0.155
Если отношение положительного к отрицательному контролю
меньше 6.0, то результаты по данному планшету не учитывают.
Если это отношение больше 6.0, то результаты учитывают.
В данном примере отношение равно 9.68, то есть больше 6.0,
следовательно результат учитывают.
Высчитывают среднее значение отрицательного контроля
(ОК):
Пример:
С1 + d1 0,135 + 0,155
ОК= --------- = --------------- = 0,145
2 2
Высчитывают среднее значение положительного контроля
(ПК):
Пример:
А1+В1 1.354+1.456
ПК = ______ = __________ = 1.405
2 2
Определяют отношение значения исследуемой пробы
сыворотки (ИС) к положительному контролю:
Пример:
ИС-ОК 0.415 -0.145
ИС/ПК = _______ = ___________ = 0.238
ПК-ОК 1.405-0.145
Если отношение ИС/ПК меньше 0.2, это означает, что проба
отрицательная;
Если отношение ИС/ПК равно или больше 0.2, это означает,
что проба положительная.
5.2. Количественная оценка (определение титра антител).
а) при визуальном учете
При визуальном учете сравнивают окраску содержимого лунок
планшета испытуемых проб с окраской лунок контрольных образцов.
За титр испытуемой сыворотки принимают последнее разведение
ее, при котором наблюдают видимое глазом цветовое окрашивание,
более интенсивное по сравнению с отрицательным
контролем. Положительными считают пробы, начиная с разведения
1:200 и выше.
б) при инструментальном учете
При инструментальном фотометрическом учете результатов
анализа конечным разведением испытуемой сыворотки считается
последнее ее разведение, в котором оптическая плотность
превышает таковую отрицательного контроля в 2,0-2,1 раз.
в) Расечёт титра сыворотки по одному разведению (1:400)
проводят по формуле.
log ТИТР = 1.53(log ИС/ПК) + 3.93
10 10
Пример:
Отношение ИС/ПК=0.238
log ТИТР = 1.53(log 0.238) + 3.93
10 10
log ТИТР = 1.53(-0.623) + 3.93
10
log ТИТР = 2.976
10
ТИТР = antilog 2.976
ТИТР = 946
6. Гарантии изготовителя
6.1 Предприятие-изготовитель гарантирует активность
специфических компонентов набора в течение 12 месяцев со дня
изготовления при соблюдении потребителем указанных выше
условий хранения и использования данных препаратов.
6.2 Все претензии и замечания по качеству препарата
предъявлют в соответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России от
8 мая 1992г. №22-7/28 "О порядке предъявления рекламаций на
ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по
импорту" во bНИИЗЖ,ЦНМВЛ и сообщают во Всероссийский государственный
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и
сертификации ветеринарных препаратов и одновременно
направляют нарочным набор этой серии.
Временное наставление разработано во Всероссийском научно-
исследовательском институте защиты животных.
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 18 июня 1998
года, протокол №3 (№000697-ОП).