МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Минсельхозпрод России) 2.09.98г. n 13-7-2/1380 ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ по применению антигена бруцеллезного эритроцитарного для реакции непрямой гемааглютинации (РНГА) в порядке широкого производственнного испытания на 20 млн. исследований до 2000г. 1.0БЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА предназначен для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота. 1.2. Антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА представляет собой бесцветную прозрачную жидкость с осадком эритроцитов, легко разбивающимся в гомогенную взвесь коричнево-красного цвета. 1.3. Антиген расфасован по 10-20 мл в стеклянные флаконы, укупоренные резиновыми пробками и обкатанные алюминиевыми колпачками. 1.4. На флаконы наклеивают этикетки или несмываемой краской наносят следующие обозначения: наименование предприятия-изготовителя, наименование препарата, количество препарата во флаконе, номер серии, номер контроля, дату изготовления, срок годности, рабочее разведение антигена, обозначение ТУ. 1.5. Флаконы укладывают в картонные коробки, обеспечивающие их неподвижность и целостность. 1.6. На каждую коробку наклеивают этикетку с указанием: предприятия-изготовителя и его товарного знака, наименования препарата, количества флаконов, количества препарата во флаконе в мл , номера серии, номера контроля, даты изготовления, срока годности, условий хранения, рабочего разведения антигена, обозначения технических условий. В каждую коробку вкладывают наставление по применению препарата. 1.7. Флаконы с антигеном, содержащим посторонние примеси, пле- сень, неразбивающиеся конгломераты, подвергшимся замораживанию, выбраковывают. 1.8. Антиген хранят на предприятии-изготовителе и у потребителя в сухом темном помещении при температуре 2-10°С в пределах срока годности. 1.9. Срок годности антигена - 18 месяцев со дня изготовления. 1.10. Крупный рогатый скот, иммунизированный вакциной из штамма 82, исследуют в РНГА в следующие сроки: 1.10.1. Телок , привитых в 4-5 месячном возрасте, - через 10 мес после вакцинации; 1.10.2. Телок случного возраста - через 10 мес после вакцинации или через 6 мес после ревакцинации; 1.10.3. Коров-первотелок - через 1-2 месяца после отела всех животных группы и затем через 6 мес. после ревакцинации; 1.10.4. Коров - через 6 мес после вакцинации или ревакцинации. 1.10.5. Телок, иммунизированных в 4-5 месячном возрасте вакциной из шт. 19, - через 10 мес и затем через 6 мес после ревакцинации шт. 82. 1.10.6. Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследуют. 2 . ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ 2.1. Получение сыворотки. 2.1.1. Для исследования в РНГА в лабораторию направляют кровь или сыворотку крови животных. Кровь у животных берут из яремной вены в стерильные пробирки по 5-10 мл. Пробирки нумеруют и составляют опись проб. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают при температуре 37-38°С в течение 1 ч. или при 10-20°С в течение 12-24 ч. Сгусток крови отделяют от стенок пробирки стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4-10°С. Через 16-24 ч. отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют в лабораторию на исследование в свежем или консервированном виде. 2.1.2. Консервирование сыворотки проводят: - добавлением 0,05 мл (1капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки; - добавлением сухой борной кислоты (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов; - путем однократного замораживания. Не консервированная сыворотка пригодна для исследования в течение 6 сут. со дня взятия крови при условии хранения ее при 4-10 С. Сыворотка, консервированная фенолом или борной кислотой, пригодна для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки - в течение 3 сут. после оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат. 2.2. Подготовка оборудования Для проведения РНГА необходимы: -штативы для пробирок; - пробирки Флоринского; - планшеты полистироловые 72-луночные (вместимостью лунки 2 мл); -дозаторы групповые Флоринского; - пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл. Полистироловые планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые планшеты погружают на 20-30- мин в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе ватной пробкой. Затем планшеты несколько раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают при температуре 37°С. После постановки реакции планшеты выдерживают в 1%-ном растворе хлорамина или 0,5%-ном растворе фенола 1,5-2,0 ч. Последующая обработка планшетов производится по выше изложенной методике. 2.3. Компоненты реакции: - сыворотки исследуемые; -сыворотка бруцеллезная позитивная, изготовленная биопредприятием; - антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА; - сыворотка негативная; - физиологический раствор хлорида натрия с рН 6,2-6,5. 3. ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ. Исследование каждой сыворотки проводят в объеме 0,55 мл . Непривитый крупный рогатый скот исследуют в РНГА с разведения сыворотки крови 1:50, мелкий рогатый скот - с 1:25. Вакцинированный крупный рогатый скот исследуют с разведения сыворотки крови 1:100. При массовых исследованиях испытуемые сыворотки крови исследуют в одном разведении, при получении положительных результатов, пробы от реагирующих животных исследуют повторно в четырех разведениях. При исследовании непривитого крупного рогатого скота исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0,1 мл сыворотки в пробирки с 2,4 мл физиологического раствора. Допускается внесение 0,04 мл сыворотки в 1 мл физиологического раствора. Сыворотку крови овец берут в дозе 0,2 мл и вносят в пробирку с 2,3 мл физиологического раствора, при этом получают исходное разведение 1:12,5. При исследовании крупного рогатого скота, привитого противобруцеллезными вакцинами, готовят исходное разведение 1:50, для чего 0,1 мл сыворотки вносят в пробирку с 4,9 мл физиологического раствора. Допускается внесение 0,04 мл сыворотки крови в пробирку с 2 мл физиологического раствора. Одновременно с испытуемыми сыворотками готовят аналогичные разведения контрольных сывороток: позитивной бруцеллезной и негативной. Исходные разведения испытуемых и контрольных проб сыворотки крови в пробирках прогревают в водяной бане при 58-60°С в течение 30 минут, вносят в лунки пластины (пробирки) по 0,25 мл и добавляют 0,25 мл физиологического раствора, получая окончательное разведение сыворотки. В каждую лунку с приготовленными разведениями сыворотки основной реакции и контролями вносят по 0,05 мл (одна капля) рабочего разведения антигена (1:2) на физиологическом растворе. Содержимое лунок (пробирок) тщательно перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета (встряхивания штатива), выдерживают при температуре 20-23°С в течение 2,5-3,5 ч и проводят учет реакции. Для определения титра гемагглютининов в сыворотке крови реагирующих животных в лунки (пробирки) первого, второго, третьего и четвертого рядов вносят по 0,5 мл физиологического раствора, затем в лунки первого ряда добавляют по 0,5 мл исходного разведения сыворотки и смешивают с физиологическим раствором. Затем из лунки первого ряда по 0,5 мл сыворотки переносят в последующие, из четвертого ряда 0,5 мл смеси удаляют. Таким образом получают последовательные двукратные разведения каждой исследуемой сыворотки крови, после чего во все лунки (пробирки) добавляют по 0,05 мл рабочего разведения антигена на физиологическом растворе. Допускается постановка реакции в два этапа: накануне готовят разведения испытуемых и контрольных проб сыворотки крови, прогревают при указанном выше режиме и хранят до следующего дня при 2-8°С, затем проводят исследование. 4. УЧЕТ РЕАКЦИИ Учет реакции непрямой гемагглютинации проводят визуально в крестах по следующей схеме: "++++"(4 креста) - 100%-ная агглютинация эритроцитов, гладкий налет по всему дну лунки, возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде "зонтика". "+++"(3 креста) - 75%-ная агглютинация в виде хорошо выраженного "зонтика" меньшего диаметра, чем при оценке реакции на 4 креста. В центре лунки возможно образование малозаметного кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов. "++"(два креста) - на дне лунки осевшие неагглютинированные эритроциты образуют ровное кольцо с зернистостью вокруг него (50%-ная агглютинация). "+"(1 крест) - эритроциты оседают в виде компактной "пуговки" или колечка. За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла четкая агглютинация эритроцитов с оценкой 4 или 3 креста. Все сыворотки, давшие РНГА с оценкой в 2 или 1 крест, считают отрицательными. 5. ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РНГА 5.1. Реакцию считают положительной при наличии гемагглютинации с сывороткой крови не вакцинированных животных против бруцеллеза в следующих показателях: для крупного рогатого скота в разведении сыворотки крови 1:100 и выше, для овец и коз - 1:50 и выше с оценкой 4 или 3 креста. 5.2. При выявлении среди не вакцинированного против бруцеллеза крупного рогатого скота , сыворотки крови которых дают положительную реакцию в разведении 1:50, а овец и коз -1:25, их считают сомнительно реагирующими и обследуют повторно через 15-30 сут. в РНГА и РИД. При повышении титров в РНГА или положительной РИД заболевание считается установленным; при сохранении прежних титров в РНГА и отрицательной РИД животных признают здоровыми. 5.3. При исследовании крупного рогатого скота, вакцинированного против бруцеллеза, животных, положительно реагирующих в разведениях сыворотки крови 1:200 и выше, признают больными и с ними поступают в соответствии с положениями Санитарных правил СПЗ.1.085-96 и Ветеринарных правил ВП В. 1302-96. 5.4. При выявлении в стадах крупного рогатого скота, вакцинированного против бруцеллеза, животных положительно реагирующих в РНГА только в разведении сыворотки крови 1:100 их считают сомнительно реагирующими и повторное исследование проводят через 15-30 сут в РНГА и РИД. При повышении титров в РНГА или положительной РИД, заболевание считается установленным. 5.5. Отары овец и коз признают неблагополучными по бруцеллезу в случаях выявления положительно реагирующих в РНГА животных с титрами 1:50 и выше. 6. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ В случае несоответствия препарата требованиям, указанным в настоящем Наставлении, применение данной серии антигена прекращают и, в соответствии с Указанием Главного управления ветеринарии Минсельхоза России от 8 мая 1992 года № 22/28 "О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту", сообщают об этом предприятию-изготовителю. Всероссийскому государственному научно-исследовательскому институту контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе,д. 5) и Центральной научно- производственной ветеринарной лаборатории (111622, Москва, ул. Оранжерейная, д. 23). Одновременно в адрес ВГНКИ направляют 3 невскрытых флакона антигена данной серии, соблюдая температурный режим, указанный в наставлении . Наставление разработано Прикаспийским зональным научно- исследовательским ветеринарным институтом (г. Махачкала), Всероссийским государственным научно-исследовательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (г. Москва) и Всероссийским научно-исследовательским институтом бруцеллеза и туберкулеза животных (г. Омск). Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 1998 г, протокол № Начальник отдела ветеринарно-санитарной экспертизы и лабораторных работ Департа- мента ветеринарии Минсельхозпрода РФ В.И.Белоусов