МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Зам. руководителя
Департамента ветеринарии
Департамент ветеринарии
n 13-7-2/1264 5 июня 1998 г.
ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора компонентов
для диагностики реовирусного теноси-
новита кур иммуноферментным методом
(в порядке широкого производственного
испытания 1998-2000 гг.)
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Набор предназначен для выявления в сыворотках крови и желтках яиц
кур специфических антител к реовирусу теносиновита иммуноферментным
методом и применяется для ретроспективной диагностики и оценки
эффективности поствакцинального иммунитета против данного заболевания.
1.2. Принцип метода иммуноферментного анализа заключается в
связывании находящихся в сыворотке крови птиц специфических антител с
адсорбированным на поверхности лунок полистироловых планшет
реовирусным антигеном, образуя комплекс антиген-антитело. Последний
вступает в реакцию с мечеными пероксидазой хрена иммуноглобулинами
антивидовой сыворотки. Образовавшийся специфический комплекс выявляют
фермент-субстратной реакцией, в результате которой образуется окрашенный
продукт. Величина оптической плотности продукта ферментативной реакции
пропорциональна содержанию антител в исследуемом материале.
1.3. Набор включает следующие компоненты:
Компонент № 1 - положительная сыворотка крови кур к реовирусу
теносиновита (положительный контроль), разведенная 1:100 0,15 М
раствором хлорида натрия с содержанием 1% фетальной сыворотки,
лиофилизированная, 1,0 куб.см -1 ампула или флакон (К.1.);
Компонент № 2 - отрицательная сыворотка крови (отрицательный контроль),
не содержащая антител к реовирусу теносиновита кур, разведенная 1:100
0,15 М раствором хлорида натрия с содержанием 1% фетальной сыворотки,
лиофилизированная, 1,0 куб.см -1 ампула или флакон (К.2.);
Компонент № 3 - антиген реовируса теносиновита кур, очищенный и адсор-
бированный по 0,2 куб.см в лунках планшета для ИФА - 2 планшета (К.3.);
Компонент № 4 - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против igg
кур, лиофилизированный 0,2 или 1,0 куб.см - 1 ампула (флакон), рабочее
разведение 1:21 (К.4.);
Компонент № 5 - концентрированный разбавитель -1,5 М калий-фосфатный
буфер рН 7,2-7,4, жидкий, 10 смЗ -1 флакон (К.5.);
Компонент № 6 - разбавленный детергент твин-20, твин-80 или тритон Х-100,
жидкий, 5 куб.см -1 флакон (К.6.);
Компонент № 7 - 5-аминосалициловая кислота, порошок, 20 мг. - 1 флакон
или 1 пробирка для микропроб (К.7.);
Компонент № 8 - гидроперит, таблетка в стандартной упаковке, 1,5 г - 1 шт.
(К.8.).
1.4. На ампулы (флаконы) с иммуноспецифическими компонентами
наклеивают этикетки с указанием: наименования препарата, объема в ампуле
в куб.см, рабочего разведения, номера серии, номера контроля, срока годности.
На флаконы с неспецифическими компонентами наклеивают этикетки, на
которых указывают наименование компонента, его количество во флаконе (смЗ
или мг), номер серии, срок годности. Ампулы и флаконы с компонентами
упаковывают в картонные коробки с наличием гнезд или перегородок,
обеспечивающих неподвижность ампул и целостность препарата.
На коробку с набором наклеивают этикетку, на которой указывают:
наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, название набора,
название компонентов входящих в набор, количество ампул (флаконов)
каждого компонента в коробке, объем препарата в одной ампуле (флаконе),
номер серии, номер контроля, дату изготовления (месяц, год), срок годности,
условия хранения, обозначение ТУ.
В каждую коробку вкладывают наставление по применению набора. Набор
расчитан на исследование 176 проб сывороток крови кур без раститровки, а
при раститровке - на 22 пробы.
1.5. Срок годности набора 12 мес со дня изготовления при хранении в
защищенном от света месте при температуте (4-8)гр.С.
1.6. Браковка. Ампулы или флаконы без этикетки, с трещинами, с
измененным цветом и консистенцией бракуют и обезвреживают кипячением в
течение 30 мин.
2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
2.1. Для исследования в лабораторию доставляют по 20-25 проб
(0,2-0,3) куб.см сывороток крови птиц разных возрастных групп из птицехозяйств,
где имеется подозрение на данное заболевание.
2.2. Для постановки иммуноферментного анализа используют: одно- и
восьмиканальные автоматические пипетки со сменными наконечниками
разных объемов, термостат с температурой нагрева (37,0+0,5)гр.С, бытовой
холодильник, рН-метр тип 121 или 340, спектрофотометр с вертикальным
лучом света.
2.3. Приготовление рабочих растворов
2.3.1. Раствор № 1- 0,01 М калий-фосфатный буфер, содержащий 0,5 М
раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией детергента (твина-20,
твина-80 или тритона Х-100), рН 7,2-7,4.
Для его приготовления необходимо растворить содержимое флакона с
концентрированным разбавителем (К.5.), содержимое флакона с
разбавленным детергентом (К.6.) и 44,0 г хлорида натрия в 1500 куб.см
дистиллированной воды, проверить рН. При необходимости рН корректируют
0,1н КОН или НСl.
Раствор используют для разведения положительной, отрицательной,
исследуемых проб сывороток крови кур, антивидового конъюгата и
промывания лунок планшетов. Хранят не более 15 суток в бытовом
холодильнике при (4-8)гр.С.
2.3.2. Раствор № 2 - содержимое ампулы (флакона) с положительной
сывороткой крови кур (К.1.) растворяют в 1,0 куб.см раствора № 1, получают
разведение положительной сыворотки 1:100, готовят перед использованием.
Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника до 15
сут.
2.3.3. Раствор № 3 - содержимое ампулы (флакона) с отрицательной
сывороткой крови кур (К.2.) растворяют с 1,0 куб.см раствора № 1, получают
разведение отрицательной сыворотки 1:100, готовят перед использованием.
Допускается хранение в морозильной камере бытового холодильника до 15
сут.
2.3.4. Раствор № 4 - содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом (К.4.)
растворяют в 21 куб.см раствора № 1. Готовят перед использованием.
2.3.5. Раствор № 5 - 1%-ный раствор naoh. Готовят растворением
1г гидроокиси натрия в 99 куб.см дистиллированной воды. Хранят не
более 15 суток при комнатной температуре 20°С.
2.3.6. Раствор № 6 - таблетку гидроперита 1,5 г (К.8.) растворяют
в 45 куб.см дистиллированной воды. Раствор хранят в защищенном
от света месте при 4-8 гр.С не более 10 суток.
2.3.7. Раствор № 7 - содержимое флакона с 5-аминосалициловой
кислотой (К.7.) растворяют в 25 куб.см горячей дистиллированной
воды (70+2)гр.С при постоянном перемешивании на магнитной
мешалке, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят рН
до 6,0+-0,1 с помощью раствора № 5. Раствор готовят
непосредственно перед использованием, не хранят.
2.3.8. Раствор № 8 - для приготовления субстратно-
индикаторной смеси к 0,1 куб.см раствора № 6 добавляют 3,3 куб.см
холодной (4-8)гр.С дистиллированной воды, затем к 2 куб.см
полученного раствора приливают 18 куб.см раствора № 7. Раствор
готовят непосредственно перед использованием, не хранят.
2.4. Постановка реакции
2.4.1. Образцы исследуемых сывороток разводят 1:100 раствором
№ 1. С этой целью к 9,9 куб.см раствора № 1 добавляют 0,1 куб.см
сыворотки крови птиц. Затем в три лунки (al, bl, c1)
вертикального ряда планшета вносят по 0,1 куб.см разведенной
отрицательной сыворотки крови (раствор № 3) и в следующие три
лунки (dl, el, f1) вносят по 0,1 куб.см разведенной 1:100
положительной сыворотки крови (раствор № 2). В лунки gl, hi
вносят по 0,1 куб.см раствора № 1, служащие для контроля конъюгата
и субстратно-индикаторной смеси.
В остальные лунки рядов b2-i2...h2-i2 вносят по 0,1 куб.см
раствора № 1, а в лунки горизонтального ряда a2-i2 по 0,2 куб.см
исследуемых проб сывороток крови и проводят раститровку по
вертикальным рядам, начиная от разведения 1:100 до 1:12800. С
этой целью из лунок a2-i2 отбирают по 0,1 куб.см разведенных
исследуемых сывороток крови и переносят в лунки b2-i2
соответствующего ряда, пипетируют и проводят двукратное
разведение переносом по 0,1 куб.см в очередную лунку вертикального
ряда планшета, удаляя из последних лунок h2-i2 по 0,1 куб.см.
2.4.2. Планшет осторожно встряхивают для перемешивания
содержимого, закрывают крышкой и переносят в термостат
(37,0+0,5 гр.С) на 30 мин. Затем лунки планшета освобождают от
содержимого путем вытряхивания, трехкратно промывают
раствором № 1 и подсушивают путем постукивания по
фильтровальной бумаге.
2.4.3. Готовят раствор № 4 по п.2.3.4. и вносят во все лунки
планшета по 0,1 куб.см, затем помещают в термостат на 30 мин. После
чего конъюгат удаляют, лунки трехкратно промывают и подсушивают
путем постукивания перевернутым планшетом по фильтровальной
бумаге.
2.4.4. Готовят субстратно-индикаторную смесь по п.2.3.8. и вносят
во все лунки планшета по 0,1 куб.см. Планшет оставляют при комнатной
температуре в темном месте на 15-20 мин.
2.4.5. Выявление специфических антител в сыворотках крови кур
иммуноферментным методом можно проводить и без раститровки
испытуемых сывороток.
В этом случае в три лунки (al, bl, c1) вертикального ряда
планшета вносят по 0,1 куб.см разведенной 1:100 отрицательной
сыворотки крови (отрицательный контроль), а в следующие три лунки
(dl, el, f1) вносят по 0,1 куб.см разведенной 1:100 положительной
сыворотки (положительный контроль). В лунки gl, hi вносят по 0,1
смЗ раствора № 1, служащие для контроля конъюгата и субстратно-
индикаторной смеси. В лунки В2...Н2 вносят по 0,1 куб.см раствора №1,
а в лунки А2 по 0,2 куб.см положительной сыворотки и проводят
раститровку по вертикальному ряду А2-Н2. В остальные лунки
рядов АЗ-12...НЗ-12 вносят по 0,1 куб.см исследуемых проб сывороток
крови кур в разведении 1:100, используя по одной лунке на каждую
пробу. Остальные этапы постановки реакции проводят аналогично
п.п. 2.4.2.-2.4.4.
2.5. Учет результатов реакции
2.5.1. Учет результатов анализа проводят через 15-20 мин
визуально - по интенсивности окрашивания содержимого лунок
планшета или инструментально - с помощью спектрофотометра с
вертикальным лучом света при длине волны 450 нм.
2.5.2. При визуальном способе учета первоначально проводят
оценку результатов по контрольным лункам планшета: содержимое
лунок с положительной сывороткой (положительный контроль)
должно быть интенсивно окрашено в коричневый цвет. Содержимое
лунок с отрицательной сывороткой (отрицательный контроль) и
контроль конъюгата должно быть бесцветным или иметь бледно-
соломенное окрашивание.
При отсутствии необходимости строгого количественного
определения содержания специфических антител в исследуемых
пробах сывороток крови учет результатов ИФА проводят
визуально, сравнением цветового окрашивания содержимого
лунок исследуемой сыворотки с интенсивностью окраски
продукта пероксидазной реакции титруемого положительного
контроля. Интенсивность цветового окрашивания продукта
пероксидазной реакции пропорциональна содержанию
антител к реовирусу теносиновита кур.
Раститровка проб испытуемых сывороток крови дает возможность
количественно оценить концентрацию специфических антител. За
титр сыворотки принимается наивысшее ее разведение, при котором
еще достаточно четко видна разница цветового окрашивания по
сравнению с отрицательной сывороткой крови.
2.5.3. Спектрофотометрический учет результатов ИФА позволяет
количественно оценить содержание антител в исследуемых пробах
путем измерения значений оптической плотности с одновременной
записью результатов реакции с каждой лунки планшета на
специальной бумажной ленте или листе бумаги. Различие между
средним значением положительного контроля и средним значением
отрицательного контроля должно быть более, чем 0,10. Наличие или
отсутствие антител против реовируса устанавливается сравнением
значений оптической плотности тестируемой сыворотки (s) с
положительным контролем (Р). Проба сыворотки с s/p-отношением
ниже 0,2 должна расцениваться как отрицательная. Если s/p-
отношение равно или больше, чем 0,2, то исследуемая проба
должна расцениваться как положительная.
При определении конечного титра исследуемой пробы по одному
разведению 1:100, следует воспользоваться ниже приведенным
уравнением.
При титровании сывороток за титр реовирусных антител
принимается разведение, где значение оптической плотности
на 0,10 о.е. превышает значение оптической плотности, полученное
с отрицательного контроля.
Расчет:
1. Среднее лунка А1(ОП450) + лунка В1(ОП450) + лунка
С1(ОП450)= (nkx) -----------------------------------------
3
значение
отрицательного
контроля (nkx)
2. Среднее лунка d1(ОП450) + лунка Е1(oП450) + лунка
f1(ОП450) =(РКх) ------------------------------------------
3
значение
положительного
контроля (РКх)
3. s/p-отношение значение ОП450 исследуемой пробы - nkx = s/p
pkx-nkx
4. Титр. Ниже следует уравнение, связывающее s/p-значение при
одном разведении 1:100 с конечной точкой титра:
lg титр = 2,19 (lg s/p) + 3,59
2.6. Оценка результатов реакции
При обнаружении в сыворотках крови птиц разных возрастных
групп, невакцинированных против реовирусного теносиновита,
специфических антител в титрах 1:100 и выше у более, чем 50%
исследуемых проб дает основание для постановки диагноза на
данное заболевание. При этом учитывают эпизоотическую
ситуацию в птицехозяйстве, наличие клинических и
патологоанатомических признаков заболевания.
Для окончательной постановки диагноза на данное
заболевание необходимо провести вирусологические исследования
по выделению вируса из патологического материала (пораженные
суставы, почки, селезенка, печень).
Оценкой эффективности поствакцинального иммунитета
является выявле-ние в сыворотках крови птиц специфических
антител в титрах не ниже, чем 1:400 у 80% вакцинированной птицы.
2.7. При выявлении неактивности компонентов набора,
применение его прекращают и в соответствии с указанием ГУВ
Минсельхоза России от 8 мая 1992 года № 22-7/28 "О порядке
предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного
производства и закупаемые по импорту" сообщают об этом
предприятию-изготовителю во Всероссийский государственный
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и
сертификации ветеринарных препаратов (123022- г. Москва,
Звенигородское шоссе,5)и ПНМВЛ (г.Москва,ул,Оранжерейная,23).
Одновременно в адрес института направляют 1 невскрытый набор.
Временное наставление разработано Всероссийским научно-
исследовательским ветеринарным институтом птицеводства.
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 17.12.97 г. ,
протокол № 5 (000623-ОП)