МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Минсельхозпрод России) ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ 24.07.98г. n 13-7-2/1337 ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ по применению набора для выявления стафилококковых энтеротоксинов типов "А" и "В" в мясе методом иммуноферментного анализа (В порядке широкого производственного испытания до 2001 года) 1.ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ 1.1. Диагностический набор предназначен для определения стафилококковых энтеротоксинов (СЭ) типа А и В в мясе методом иммуноферментного анализа. Чувствительность тест-системы составляет не менее 1 нг/мл. 1.1 Диагностический набор состоит из упакованного в коробки комплекта препаратов: 1)Иммуноглобулин (igg) специфический к стафилококковому энтеротоксину типа А.Используется для сенсибилизации полистироловых планшетов (1 микропробирка, 100 мкд.рабочее разведение указано на этикетке). 2) Иммуноглобулин(igg) специфический к стафилококковому энтеротоксину типа В.Используется для сенсибилизации полистироловых планшетов (1 микропробирка, 100 мкл.рабочее разведение указано на этикетке). 3) Биотинилированный иммуноглобулин(igg) специфический к стафилококковому энтеротоксину типа А(1 микропробирка, 100 мкл,рабочее разведение указано на этикетке). 4) Биотинилированный иммунопгобулин(igg) специфический к стафилококковому энтеротоксину типа В(1 микропробирка. 100 мкл.рабочее разведение указано на этикетке). 5) Контрольный раствор стафилококкового энтеротоксина типа А. Используется для построения калибровочного графика (1 микропробирка, 300 мкл, с концентрацией 10 нг/мл). 6) Контрольный раствор стафилококкового энтеротоксина типа В. Используется для построения калибровочного графика (1 микропробирка,300 мкл, с концентрацией 10 нг/мл). 7) Раствор авидина, конъюгированный с пероксидазой (1 микропробирка, 30 мкл,рабочее разведение указано на этикетке). 8) Ортофенилендиамин (1 микропробирка, 2 мг). 9) Твин-20 ( 1 микропробирка, 1 мл). 10) Полистироловые планшеты - 2 шт. Один комплект рассчитан на проведение 80 анализов: по 40 проб на тип А и В. 1.3.Упаковка и маркировка. На микропробирки с каждым компонентом наклеены этикетки с указанием: названия компонента, количества препарата в ампуле и рабочего разведения препарата, а для неспецифичсских компонентов - краткого названия компонента, количества препарата в емкости. На каждую коробку с диагностическим набором наклеена этикетка, в которой указаны: наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, полное название набора, перечень компонентов, входящих в набор, количество микропробирок каждого компонента, количество препарата в каждой микропробирке, титр (рабочее разведение), номер серии набора, номер госконтроля, дату изготовления набора (месяц и год), срок годности, условия хранения и обозначения настоящих ТУ. В каждую коробку с набором вложено наставление по применению диагностического набора, утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России. 1.4. Температура хранения и транспортирования набора(5 ± 3) гр.С. Срок хранения -6 месяцев со дня изготовления. 2.ПОРЯДОК ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ 2.Для проведения ИФА готовят следующие растворы и ингредиенты: Раствор n 1. Карбонат-бикарбонатный буферный раствор с рН 9,6 г +- 0,1. Состав: натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201-79, натрий угаекислый безводный по ГОСТ 83-79. Для приготовления буферного раствора берут 1,59 г натрия углекислого и 2,93 г натрия углекисислого кислого и помещают в колбу вместимостью 1 л, добавляют 500 мл дистиллированной воды. Время растворения (20 - + 5) мин. при комнатной температуре. После полного растворения ингредиентов объем раствора доводят до 1 л дистиллированной зодой. Раствор n 2. Фосфатао-солевой буферный раствор , рН 7,3 ± 0,1. Состав: натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12-водный по ГОСТ 4172-76, калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198-75, калий хлористый по ГОСТ 4234-77,натрий хлористый по ГОСТ 4233-77, твин-20. Берут 8,0 г натрия хлористого, 7,16 г натрия фосфорнокислого двухзамещенного , 0,2 г хлористого калия, 0,2гкалия фосфорнокислого однозамещенного и помещают в мерную колбу вместимостью 1 л с 500 мл дистиллированной воды. Время растворения - (25 ± 5) минут при непрерывном перемешивании. После полного растворения ингредиентов объем доводят до 1 л дистиллированной водой и определяют рН. К 500 мл раствора добавляют 0,25 мл твина-20. Оставшиеся 500 мл раствора n2 ,не содержащего твин-20, используют как раствор n 3. Хранят не более трех недель при температуре (6 ± 2)гр.С. Раствор n 3. Фосфатно-солевой буферный раствор такого же состава, как и раствор n 2, но без твина-20. Раствор n 4. Индикаторная субстратная смесь. Состав: кислота лимонная по ТУ 6-09-10- 850-78, натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12-водный по ГОСТ 4172-76, ортофенилеядиамин по ТУ-6-09-1127.76, перекись водорода по ГОСТ 10929-76. В мерной колбе вместимостью 25 мл смешивают 6,1 мл раствора лимонной кислоты концентрацией 0,1 моль/л (1,92 г растворяют и доводят до 100 мл дистиллированной водой) и 6,4 мл раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия концентрацией 0,2 моль/л (7,16 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 12-водного растворяют в 100 мл дистиллированной воды). После смешивания объем полученного раствора доводят до 25 мл дистиллированной водой, рН раствора должен быть 5.0 ± 0.1. Хранят готовый нитратно фосфатный буферный раствор не более трех суток при температуре (5 ± 2) °С. Непосредственно перед использованием 10 мл полученного раствора переносят во флакон, растворяют в нем 2 мг ортофенилендиамина и добавляют 15 мкл концентрированного (30%) раствора перекиси водорода. Раствор n 5. Останавливающий реакцию раствор. Состав: серная кислота по ГОСТ 4201-77. Готовят раствор серной кислоты концентрацией 2 моль/л. Для этого в мерную колбу вместимостью 250 нл наливают 150 мл дистиллированной воды, добавляют 28 мл концентрированной кислоты, перемешивают а доводят объем раствора до 250 мл дистиллированной водой. Хранят в течение месяца при комнатной температуре. Раствор n 6. Раствор иммуноглобулинов против СЭ. В мерную колбу вместимостью 10 мл наливают 5 мл раствора n 3, добавляют из пробирки, содержащей иммуноглобулины против соответствующего СЭ , такой объем раствора, чтобы подучить указанное на этикетке рабочее разведение иммуноглобулинов. Объем доводят до 10 мл раствором n 3. Раствор n 7. Рабочий раствор биотинилированных антител. В мерную колбу вместимостью 10 мл наливают 5 мл раствора n 3, добавляют из пробирки, содержащей биотинилированные антитела, такой объем раствора, чтобы подучить указанное на этикетке рабочее разведение биотинилированных антител. Объем доводят до 10 мл раствором n 3. Раствор n 8. Рабочий раствор конъюгата авидин-пероксидазы. К 10 мл раствора n 3 добавить из микропробирки такой объем раствора конъюгата, чтобы получить указанное на микропробирке рабочее разведение. Раствор n 9. Контрольный образец СЭ с концентрацией 10 нг/мл. 2.2. Для приготовления проб с целью определения СЭ от партии мясного сырья берут кусочки мяса размером примерно 1х1 см и измельчают в гомогенизаторе до получения фарша.К навеске фарша массой два грамма добавить 4.0 мл фосфатно-буферного раствора с рН 7.2 - 7.4 (раствор n 3),тщательно перемешивают и центрифугируют пробу при 2000 g в течение 10 минут, надосадочную жидкость по 100 мкл от каждой пробы используют для определения концентрации энтеротоксинов иммунноферментным методом в двух повторностях. ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ 2.3. Сенсибилизация планшетов. Во все лунки двух планшетов внести по 0,1 мл раствора n 6 соответствующего СЭ. Планшет накрыть крышкой и поместить на три часа в термостат при температуре (37+- 0,5)гр.С или на ночь в холодильник (4 - 8)гр.С. Удалить содержимое лунок стряхиванием, промыть дважды раствором n 2 и четырежды - раствором n3. 2.4. Внесение стандартных разведении СЭ. Из раствора n 9 приготовить восемь двукратных разведений СЭ на растворе n 3 так, чтобы получить интервал концентрации от 10 до 0,08 нг/мл.Для этого в лунку А2 вносят 200 мкл раствора n9,a в остальные лунки до Н2 - по 100 мкл раствора nЗ.Затем по 100 мкл из лунки А2 раститровывают до Н2 для получения указанных разведений. Ряд a1,b1,c1,d1,e1,f1,g1,h1 используют в качестве контроля,внося все компоненты, кроме стандартов СЭ. 2.5. Каждый анализируемый образец (по 0,1 мл) внести в две лунки. Планшет инкубировать 30 минут при 37 гр., промыть по п. 1. 2.6. Внесение биотинилированных иммуноглобулинов. В каждую лунку внести по 0,1 мл раствора n 7, инкубировать планшеты 30 минут при 37 °С и промыть по п.2.3. 2.7. Внесение конъюгата авидин-псроксидазы. В каждую лунку внести по 0,1 мл раствора n 8, инкубировать планшеты 30 минут при 37 °С и промыть их по п.2.3, 2.8. Внесение субстратной смеси. Во все лунки внести по 0,1 мл раствора n 4, инкубировать планшеты 15-20 минут при 20 ± 2 °С. Во все лунки добавить по 0,1 мл раствора n 5. 3. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ 3.1.Учет результатов проводят визуально или инструментально на регистрирующем фотометре при 492 нм. 3.2. Визуальный учет - проводят сравнением интенсивности окраски лунок с испытуемыми пробами с интенсивностью окраски лунок титрованного стандарта СЭ и контроля. Количественное содежание СЭ в пробе будет соответствовать концентрации стандарта СЭ в лунке с одинаковой интенсивностью окраски при бесцветном контроле. 3.3. Инструментальный учет - количественное содержание СЭ в пробе будет соответствовать предельному разведению стандарта СЭ в лунках,где оптическая плотность пробы и стандарта в два раза превышает поглощение в контроле, но при значениях оптической плотности не менее 0,1. 3.4. Заключение: при выявлении стафилококковых энтеротоксинов типа А или В в мясе в количестве 2 нг/мл и более партию продукции мяса направляют на техническую утилизацию. 3.5. В случае несоответствия набора требованиям, указанным в настоящем наставлении, неспецифичности и снижения активности биологических компонентов, применение наборов данной серии прекращают и в соответствии с указанием ГУВ МСХ РФ от 08.05.98г. № 22-7\28 " О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемой по импорту" сообщают во ВРНКИ ( 123022, Москва, Звенигородское шоссе,5) , предприятию-изготовителю, в ЦНПВЛ ( 111622, Москва, ул. Оранжерейная, 23). При наличии невскрытых наборов, один набор упаковывают, опечатывают и отправляют с нарочным или почтой во ВГНКИ. Наставление разработано НИЦТБП и ВНИМП. Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 21.05.1996 г. Протокол №3 (№ 000411 - ОП). МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ СОВЕТ ПО ВЕТЕРИНАРНЫМ ПРЕПАРАТАМ (ВЕТФАРМБИОСОВЕТ) 123022 РОССИЯ, Москва, Звенигородское шоссе 5, ВГНКИ т. (095) 256-32-07, 256-61-45 ВЫПИСКА ИЗ ПРОТОКОЛА № 3 Заседания Совета по ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации 21 мая 1996 года 1.6. СЛУШАЛИ: доктора ветеринарных наук Р.В.Боровика и кандидата биологических наук З.Ф.Богаутдинова о материалах по разработке "Набора для определения стафилококковых энтеротоксинов типа "А" н "В" и мясе животных нммуноферментным методом". ПОСТАНОВИЛИ: 1. Рекомендовать проведение широкого производственного испытания "Набора для определения стафилококковых энтеротокснноп типа "А" и "В" п мясе животных методом ИФА". 2. Авторам доработать н представить для утверждения в установленном порядке проекты временного наставления и ТУ на опытно- промышленную серию. Принято единогласно. Первый Заместитель председателя Ветфармбиосовета А.Д.Третьяков