МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО
ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
Департамент ветеринарии
17.08.98 n i3-7-2/1350
ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы
«МИК-ГАЛ» для выявления возбуди-
теля микоплазмоза m.gallisepticum
методом полимеразной цепной
реакции
(для широкого производственного испытания до 01.01,2000г.)
1. Общие положения
1.1. Тест-система предназначена для выявления ДНК m.gallisepticum
методом полимеразной цепной реакции(ПЦР) в материале от больной и павшей
птицы, эмбрионов. Тест-система рассчитана на проведение 100 анализов.
В состав тест-системы входят:
1) набор для выделения ДНК(набор n 1)
2) набор для проведения ПЦР(набор n 2)
3) набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР(набор n 3)
1. 2. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
Лизирующий раствор- 1 пробирка,30 мл
Отмывочный раствор№1 1 пробирка,20 мл
Концентрат для отмывочного раствора №2 1 пробирка,20 мл
Суспензия сорбента 1 пробирка, 2 мл
Буфер для элюции ДНК с сорбента 2 пробирки по 5 мл
1.3. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:
Деионизированная вода 1 пробирка, 1 мл
Смесь праймеров 1 пробирка, 0,25мл
Смесь нуклеотидов 1 пробирка, 0,25 мл
Ферментtaq-полимераза 1 пробирка, 0,05мл
5-кратный реакционный буфер 1 пробирка, 0,5мл
Положительный контрольный образец ДНК 1 пробирка, 0,1мл
Масло минеральное - 1 пробирка, 5,0мл
Воск для ПЦР- 1 пробирка, 1 мл
1.4. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор n3)
состоит из следующих компонентов:
5-кратный буфер - 2флакона по 50мл
Агароза для электрофореза- 2 пробирки по 2 г
Бромид этидия 1%-ный - 1 пробирка, 0,15 мл
1.5. Упаковка и маркировка
1.5.1.Тест-система должна быть упакована в картонную коробку с этикеткой,
на которой указаны: полное наименование тест-системы, перечень наборов,
входящих в нее, наименование предприятия-изготовителя, номер серии, номер
контроля, дата изготовления, срок годности, условия хранения и обозначения
настоящих ТУ. В каждую упакову вкладывают наставление по применению тест-
системы.
Внутрь коробки тест-системы вложены три меньшие коробки с вышепере-
численными наборами. На этикетке каждого из наборов должно быть указано
наименование набора, перечень компонентов, количество пробирок каждого
компонента, количество препарата в каждой пробирке, номер серии набора, дата
изготовления, срок годности, условия хранения.
На пробирки с каждым компонентом должна быть нанесена этикетка с
указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке ,
номера серии и даты изготовления.
1.6. Транспортирование и хранение.
Транспортируют тест-систему при температуре (2-8)°С.
Хранят на предприятии-изготовителе и в организации-потребителе при темпера-
туре (2-8)°С
При получении и вскрытии коробки тест-системы исследователем можно хранить
набор для выделения ДНК и набор для электофоретического анализа продуктов
ПЦР - при температуре(2-25)°С в темном сухом месте, а набор для проведения
ПЦР - при температуре (2-8) °С.
1.7. Срок годности
Тест-система пригодна для применения в течение 6 мес со дня изготовления.
2.Принцип реакции.
В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в
исследуемой пробе при температуре 95 °С, отжига специфических
олигонуклеотидных затравок (праймеров) при температуре 61 °С и синтеза
комплементарных цепей ДНК с помощью фермента при температуре 72°С.
3. Подготовка исследуемого материала
3.1. Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся
пипеточными дозаторами переменых объемов( типа"Ленпипет") с использованием
одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 мл и 10,0 мл (ПО "Ленполимер") и
наконечников с аэрозольным барьером.
Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна
сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный
раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.
3.2.Для анализа используют следующий материал:
Пробы назальных и конъюнктивальных смывов, истечениий, материал от
замерших эмбрионов (желток, аллантоисная жидкость, хорион-аллантоисная
оболочка), от эмбрионов-задохликов (трахея, легкие), кусочки паренхиматозных
органов, трахеи, воздухоносных мешков от павшей птицы размером 3х3х3 мм
помещают в пробирки вместимостью 1,5мл , тщательно растирают отдельными
стеклянными палочками, добавляют по 1 мл физиологического раствора и
тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при температуре (20-25)°С в
течение 30 мин, после чего верхнюю фазу переносят в пробирки вместимостью 1,5
мл и центрифугируют при 11 тысячах об/мин в течение 10 мин. Надосадочную
жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического
раствора и используют для выделения ДНК.
Пробы цельной крови, консервированной 6%-ым ЭДТА, 1/20 к объему,
вносят по 100 мкл в пробирку и используют для выделения ДНК без
предварительной подготовки.
4. Проведение ПЦР-анализа
4.1.ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах),
для работы в которых дополнительно требуются следующие материалы и
оборудование:
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1
- настольный бокс с бактерицидной лампой "Циклотемп"(СП "РТС");
- термостат для пробирок типа "эппендорф"на (25-100)°С("Биоком");
- микроцентрифуга до (12-16) тысяч д ("elmi", "hettish");
- центрифуга/вортекс "micro-spin","Мinigеп"("Биоком);
- отдельный набор автоматических пипеток переменого объема("Биоком");
- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером ("Биоком","Хеликон");
- одноразовые пробирки на 1,5 мл типа "эппендорф"("Хеликон");
- штативы для пробирок, наконечников ("Хеликон");
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- холодильник на (2-8)°С с морозильной камерой.
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2.
- амплификатор ("ДНК-технология", "perkin elmer");
- ПЦР-бокс "Циклотемп"(СП"РТС") или отдельный стол с УФ-лампой;
- отдельный халат;
- отдельный набор автоматических пипеток перемен, объема ("Биоком");
- одноразовые наконечники в штативах("Биоком");
- одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5мл("Хеликон");
- штативы для микропробирок на 0,5 мл ("Хеликон");
- холодильник на (2-8)°С, морозильник на минус20°С для выделенных ДНК;
- термостат для микропробирок с воском на 95°С("Биоком").
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3
- камера для горизонтального электрофореза ("Хеликон", "ДНК-технология")на 50 проб;
- источник постоянного тока на (150-200) В ("ДНК-технология");
- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей("Биоком");
- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка "Микрат-300";
- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
- аквадистиллятор;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;
- мерный цилиндр на 1л;
- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
4.2. Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из клинического материала.
Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного клинического материала
проводят с помощью набора n1. Предварительно готовят отмывочный раствор n2,
смешав в отдельном флаконе 20,0 мл концентрата из набора, 80,0 мл
дистиллированной воды и 100,0 мл 96%-ного этилового спирта.Смесь хорошо
перемешивают и хранят при температуре (20-22)°С под плотно закрытой крышкой.
Проверяют состояние сорбента - при отстаивании он должен занимать приблизи-
тельно половину объема суспензии. После этого приступают к выделению ДНК.
В ряд плотно закрывающихся полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл
(типа "эппендорф") вносят по 100 мкл предварительно подготовленных исследуе-
мых проб, а также по 100 мкл отрицательных контрольных проб - элюирующего
буфера и физиологического раствора (последний вносят в случае подготовки
пробы с его использованием) и 100 мкл положительного контрольного образца,
разведенного 1:10 деионизованной водой ( из набора n2). Добавляют по 300 мкл
лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником с аэрозольным
барьером) и тщательно перемешивают пипетированием 3-10 раз.
Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента, хорошо
перемешивают содержимое пробирки на вортексе, и оставляют в штативе на 5-7
мин. для осаждения сорбента.
Осаждают сорбент на "Микроспине" в течение 30 с и отбирают супернатант
из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный
отсос с колбой-ловушкой для отбираемой жидкости).
Добавляют по 200 мкл отмывочного раствора n1, перемешивют на вортексе
до полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его
разбивают при помощи наконечника пипетки), осаждают на "Микроспине" в течение
30 с. и отбирают супернатант.
Добавляют по 800 мкл отмывочного раствора n2 перемешивают на вортексе
до полного ресуспендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при
10 тысячах об/мин в течение 30 с, отбирают супернатант.
Повторяют процедуру отмывки раствором n2, тщательно отбирают
супернатант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в
термостате при 65 °С, в течение 5-7мин.
Добавляют 30-40 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в
термостат при 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
Осаждают на микроцентрифуге при 10 тысячах об/мин в течение1 мин.
Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.
ЭТАП 2 Постановка ПЦР (амплификация ДНК)
Пробирку с воском ставят в термостат при 95 °С до полного расплавления.
Готовят "нижнюю" реакционную смесь, смешивая праймеры и нуклеотиды в
одной пробирке из расчета по 2,5 мкл каждого компонента на пробу, включая
контрольные. Смесь хранится при (2-8)°С в течение 1 месяца.
Готовят "верхнюю " реакционную смесь, смешивая компоненты из расчета на
одну пробу, включая контрольные:
5 мкл 5-кратного реакционного буфера
4,5мкл деионизованной воды
0,5мкл taq-полимеразы.
Хорошо перемешивают на вортексе .Смесь хранится при (2-8)°С в течение 1
месяца.
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл смеси нуклеотидов с
праймерами, наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он
полностью накрыл жидкость, закрывают крышки пробирок и подписывают на каждой
название инфекции( в таком виде пробирки хранятся в морозильнике несколько
месяцев до использования, можно приготовить сразу 50-100 штук, раскапав смесь
нуклеотидов с праймерами из всего количества, заложенного в набор).
Выставляют пробирки с "нижней" смесью под воском в штатив по числу
испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа (контроль выделения ),
и добавляют пробирки для "отрицательных контролей" 2-го этапа анализа( контроль
ПЦР) и нумеруют их. Число "отрицательных контролей" 2-го этапа должно быть не
менее 10% от числа исследуемых проб.
Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, а
затем по 2 капли масла.
Под масло вносят в сответствии с маркировкой пробирок по 10 мкл ДНК проб,
включая контрольные пробы 1 -го этапа, а в качестве контрольной пробы 2-го этапа
вносят 10 мкл деионизованной воды из набора.
Набирают на амплификаторе "Терцик" программу в режиме активного точного
регулирования:
95°С - 2мин 1 цикл
95°С -10с 40 циклов
61 °С -10с 40 циклов
72°С -10с 40 циклов
10°С -12-14ч (хранение)
Запускают программу и через 1 мин устанавливают пробирки в ячейки ампли-
фикатора, закрывают крышку прибора и ждут окончания реакции (примерно 1ч 40с на
амплификаторе с активным регулированием).
После окончания реакции ( в тот же день или после хранения утром следующе-
го дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату для анализа
продуктов ПЦР, который проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК m.gallisepticum
138 п.н.
ЭТАП 3 - электрофоретический анализ продуктов ПЦР.
Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной
комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим
манипуляций в пре-ПЦР помещении (Правила проведения работ в
диагностических лабораториях, использующий метод полимеразной цепной
реакции (основные положения) 27 января 1997 г.№ 13-7-2/840.)
В мерный цилиндр наливают 50 мл 5-кратного буфера, доводят дистиллиро-
ванной водой до 500 мл, добавляют 50 мкл бромида этидия, закрывают цилиндр
парафинированной пленкой ("parafilm") и перемешивают.
Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из
термостойкого стекла объемом 250 мл, наливают 100мл готового 1-кратного
буфера и плавят на кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после
этого кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу.
Заливают агарозный гель в форму (толщина 5-6мм), помещают гребенки на
расстоянии 4см друг от друга, глубина лунок при этом должна быть 3,5-4,5 мм.
После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре) осторожно
вынимают гребенки, не повредив лунки.
Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы
лунки были обращены в сторону отрицательного электрода( ДНК из лунок будет
двигаться к положительному электроду). Наливают приготовленного буфера
столько, чтобы он покрыл гель на 4-5 мм.
Выставляют пробирки с продуктами амплификации в штатив последова-
тельно. Из под слоя масла отбирают 15 мкл и аккуратно вносят на дно лунки под
буфер. Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1-2
раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет
нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься
пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того
момента, как краситель (ксилен-цианол) пройдет 1см от лунки.
Выключают источник, переносят гель на трансиллюминатор, расположив
полосу ячейками вверх, и просматривают под ультрафиолетовым излучением.
(Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной
пластиной)
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в проходящем
ультрафиолете на чувствительную пленку типа"Микрат 300" или поляроидную
пленку.
5. Учет и интерпретация результатов
В дорожке, соответствующей "положительному контролю", должна быть
специфическая светящаяся полоса оранжевого цвета, соответствующая фрагменту
ДНК в138 пар нуклеотидов. Положительные испытуемые пробы должны содержать
специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности строго
на том же уровне, что и полоса в "положительном контроле".
"Отрицательный контроль", как и отрицательные испытуемые пробы не
должны содержать каких-либо полос, за исключением нечетких утолщенных полос
праймер-димеров, которые располагаются в нижней части дорожки.
При работе с материалом, содержащим большое количество клеток,
например, кровь, биоптаты в ПЦР участвует большое количество неспецифической
геномной ДНК. При этом в дорожках геля появляются характерные шмеры,
равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или
концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном образце
видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.
Если в дорожке отрицательного контроля выявляется специфическая
полоса, значит произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК или
продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. Результат
нельзя считать достоверным.
6. Предъявление рекламаций
В случае несоответствия препарата указанным в настоящем наставлении
требованиям, использование тест-системы прекращают и одну серию препарата
направляют с нарочным (или пересылают) во Всероссийский Государственный
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации
ветеринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе,д.5) и ЦНМВЛ
в соответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России "О порядке предъявления
рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по
импорту" № 227/28 от 8 мая 1992 года. Второй экземпляр сопроводительного
письма направляют на предприятие-изготовитель.
Временное наставление разработано Всероссийским Государственным
научно-исследовательским институтом контроля, стандартизации и сертификации
ветеринарных препаратов, Центральным научно-исследовательским институтом
эпидемиологии
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 14.04.98 г., протокол №2,
№000648-ОП.
Начальник отдела ветеринарно-
санитарной экспертизы и лабо-
раторной диагностики В.И.Белоусов