МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
МИНПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
05.06.98г. n 13-7-2/1262
ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
nо применению "Набора компонентов
для выявления антител к вирусу
инфекционной бурсальной болезни
птиц инмуноферментным анализом"
(в порядке широких производственных
испытаний в 1988-2000 г.г.)
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1. Набор предназначен для выявления в сывороткак крови
специфических антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни
птиц иммуноферментным анализом (ИФА) и применяется как
экспресс -метод для ретроспективной диагностики заболевания у
невакцинированного птицепоголовья и для контроля напряженности
поствакцинального иммунитета у птицепоголовья, привитого против
указанной болезни.
В состав набора входят:
компонент n1-положительная сыворотка крови кур к вирусу
ИББ (положительный контроль), разведенная 1:1оо,
лиофилизированная, 1 куб.см - 1 ампула (флакон).
компонент n2 отрицательная сыворотка крови кур
(отрицательный контроль), не содержащая антител к вирусу ИББ,
разведенная 1:100, лиофилизированная, 1 куб.см - 1 ампула (флакон).
Компонент n3 - очищенный антиген вируса ИББ,
адсорбированной по 0,1 куб.см в лунках планшета для ИФА - 2
планшета.
Компонент n4 - антиdидовой иммунопероксидазный конъюгат
против igg кур, лиофилизированный, о,2-1,0 куб.см - 1 ампула
(флакон).
Конпсмтмтт n 5 - набop солей для приготовления буферного
раствора; хлорид натрия (naci)- 8,76г.- 1 флакон; натрий
фосфорнокислый двузамещенный (na hРО х 12 Н О)- 3,58г- 1
2 4 2
флакон; калий фосфорнокислый однозамещенный (КН РО )-1,36г.-
2 4
1 флакон. Каждая соль фасуется в отдельный флакон.
Компонент n6-детергент твин-2О или тритон х-100, 1
пробирка для микропроб.
Компонент n 7 - 5-аниносалициловая кислота, порошок, 20 мг
-две пробирки для микропроб.
Компонент n8 - гидроперит 0,5г., таблетка навеска в
упаковке-1 шт.
1.2. На ампулы или флаконы с иммуноспецифическими
компонентами наклеивают этикетки с указанием наименования
препарата, обмема в ампуле, флаконе или пробирке в куб.см,
рабочего разведения, номepa серии, номера контроля, срока
годности.
На флаконы, пробирки для никропроб с неспецифическими
компонентами наклеивают этикетки, на которых указывают
наименование компонентов, их количество в куб.см или мг.
1.3. Ампулы и флаконы упаковывают в картонные коробки с
наличием гнезд или перегородок, обеспечивающих неподвижность
ампул и целостность препарата.
На каждую коробку с набором наклеивают этикетку, на которой
указывают наименование предприятия-изготовителя и его товарный
знак, полное название набора, номер серии, номер контроля,
название и количество ампул (флаконов, пробирок) каждого
компонента, входяшего в набор, обьем компонента в одной ампуле
(флаконе, пробирке), дату изготовления (месяц, год), срок
годности, условия крещения и обозначение ТУ. В каждую коробку
вкладывают наставления по применению,
1.4. Браковка. Наборы просматривают на соответствие
маркировки и упаковки: ампулы - на целостность, на соответствие
внешнего вида, цвета и отсутствие механических примесей. При
несоответствии вышеуказанным требованиям ампулы (флаконы) с
препаратом бракуют и обеззараживают кипячением в течение 30 мин,
1.5. Наборы хранят в закрытых помещениях в сухом темном
месте при температуре от 4 до 8 гр.С. Срок годности набора при
хранении в этих условиях - 12 месяцев со дня изготовления.
1.6.Для исследования в лабораторию доставляют сыворотки
крови птиц от 20-25 голов (по 0,2-0,3 куб.см ) из птицехозяйств, где
имеется подозрение на данное заболевание. Рекомендуется
проводить доставку парных проб сывороток крови, взятых в начале
вспышки заболевания и повторно через 10-14 сут. Отобранные
пробы хранят в морозильной камере бытового холодильника и
доставляют одновременно.
При определении напряженности поствакцинального иммунитета
в лабораторию доставляют сыворотки крови от вакцинированного
птицепоголовья спустя 5-3 недели после применения вакцины против
ИББ птиц.
2. ПОДГОТОВКА koМПОНЕНТОВ НАБОРА ОБОРУДОВАНИЯ
ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИИ
2.1.Для постановки ИФА используют:одно- и восьмиканальные
автоматические пипетки со сменными наконечниками разных объемов,
термостат с температурой нагрева (37+-0,5 гр.С), бытовой
холодильник, рн-метр (тип 121 или 340), промывочное устройство
ручное или полуавтоматическое, спектрофотометр с вертикальным
лучом или полный комплект оборудования для ИФА.
2.2. Перед приготовлением рабочих растворов набор с
компонентами выдерживают 30 мин. при комнатной температуре (18-
20 гр.С).
2.3. Приготовление растворов
2.3.1. Раствор n i 0,01 М фосфатно-буферный раствор с
0,15 М хлоридом натрия рн 7.2-7.4 и твином-20 или тритоном х-100
до конечной концентрации О,05%. Для его приготовления из набора
берут флакон с компонентом 5 (хлорид натрия), содержимое
которого вносят в мерную колбу на 1000 см, растворяют
дистиллированной водой и доводят объем до метки, получая 0,15М
раствор хлорида натрия. Затем отдельно на физиологическом
растворе (0,85%-ный раствор хлорида натрия) готовят растворы
"А", "Б".
Раствор "А". Из набора берут флакон с компонентом 5 (натрий
фосфорнокислый двузамещнный), содержимое которого вносят в
мерную колбу вместимостью 100 куб.см и растворяют физиологическим
раствором, для быстрого растворения навески соли рекомендуется
подогреть содержимое мерной колбы и довести его объем до метки
физиологическим раствором .
Раствор "Б". Готовят путем растворения содержимого флакона
с компонентом 5 (калий фосфорнокислый однозамещенный) в
физиологическом растворе и доводят объем до 100 см в мерной
колбе.
Для приготовления 0,01 М фосфатно-буферного раствора с
0,15 М хлоридом натрия рн 7,2-7,4 (ФБР) проводят смешивание
растворов "А" и "Б" в мерной колбе объемом 1000 куб.см в
следующих соотношениях: раствор "А" - 85,0 куб.см раствор "Б" -
28,0 куб.см и доводят до метки заранее подготовленным 0,15 М
раствором хлорида натрия. Затем замеряют значение рн, которое
должно быть в пределах 7,2-7,4. Если рН ниже указанного уровня,
добавляют необходимое количество раствора "А", если выше -
раствора "Б".
После приготовления ФБР рН 7,2-7,4 в этот раствор вносят
содержимое флакона с компонентом 6, получая конечную
концентрацию детергента 0,05%.
Данный раствор используют для разведения положительной,
отрицательной исследуемых проб сыворотки крови птиц, антивидового
коньюгата и межэтапной промывки лунок планшета, хранят до 15
суток в бытовом холодильнике (температура плюс 4 гр.С).
2.3.2.Раствор n 2 - содержимое ампулы - компонент 1
(положительная сыворотка крови кур) растворяют в 2,0 куб.см раствора
n 1, получают разведение положительной сыворотки 1:200. Готовят
перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере
бытового холодильника до 15 суток.
2.3.3.Раствор n 3 - содержимое ампулы - компонент 2
(отрипательная сыворотка крови кур) растворяют в 2,0 куб.см раство-
ра n1, получают рлзведение отрицательной сыворотки 1:200.
Готовят перед использованием. Допускается хранение в морозильной
камере бытового холодильника до 15 суток.
2.3.Ч. Раствор n Ч - содержимое ампулы - компонент 4
(антивидовой конъюгат) растворяют в 21 куб.см раствора n 1. Готовят
перед использованием. Допускается хранение в морозильной камере
бытового холодильника до 15 суток.
2.3.5. Раствор n 5 - навеску гидроперита (компонент 8)
растворяют в 15 куб.см дистиллированной воды. Раствор хранят в
защищенном от света месте при 4-8гр.С не более 15 суток.
2.3.6. Раствор n6 - субстратно-индикаторная смесь.
Содержимое флакона - компонент 7 (5-аминосалициловая кислота)
растворяют в колбе в 21 куб.см подогретой до 50-60 гр.С
дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и
просветления раствора, охлаждают до комнатной температуры (18-
20гр.С). Затем в содержимое колбы добавляют 0,1 куб.см раствора n 5
(гидроперит). Готовят непосредственно перед использованием. Не
хранят.
3. ПОСТАНОВКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА
3.1. Из комплекта набора берут планшет (компонент 3), в
лунках которого адсорбирован очищенный антиген вируса
инфекционной бурсальной болезни птиц и используют для постановки
иммуноферментного анализа.
3.2. Разведение испытуемых сывороток
Образцы исследуемых проб сывороток крови разводят раствором
n 1.Сс этой целью к 2,0 куб.см указанного раствора добавляют
О,01 куб.см сыворотки крови кур, перемешивают и получают разведение
1:200.
3. 3. В три лунки планшета вертикального ряда ai, ВТ, ci
вносят по 0,1 куб.см положительной сыворотки крови (положительный
контроль), а в три следующие лунки Дi.ei.fi вносят по 0,1 куб.см
отрицательной сывороткой крови (отрицательный контроль); лунки
gi, hi, в которые вносят по 0,1 куб.см раствора n 1, служат для
контроля раствора конъюгата и субстратно-индикаторной смеси
(Фоновый контроль).
3.4. В остальные лунки планшета рядов В2-В12...Н2-Н12
вносят по О,1 куб.см раствора n 1, а в лунки горизонтального ряда
А2-А12 - по 0,2 куб.см исследуемых проб сывороток крови,
подготовленных по п.3.2. и проводят раститровку по вертикальным
рядам, начиная от разведения 1:200 до 1:25600. С этой целью из
лунок ai-a12 отбирают по О,1 куб.см разведенных исследуемых
сывороток крови и переносят в лунки В2-В12 соответствующего
ряда, пипетируют и проводят двукратные последовательные
разведения переносом по О,1 куб.см в очередную лунку вертикального
ряда, удаляя из последних лунок Н2-Н12 по 0,1 куб.см .
3.5. Планшет осторожно встряхивают для перемешивания
содержимого, закрывают крышкой и переносят в термостат (37,0+-
О,5 гр. С) на 30 мин. Затем лунки планшета освобождают от содержи-
мого путем вытряхивания, трехкратно промывают (по 3 мин)
раствором n 1 и подсушивают путем постукивания планшетом по
фильтровальной бумаге.
3. 6. Готовят раствор n 4 по п.2.3.4. и вносят во все лунки
планшета по О,1 куб.см , затем помещают в термостат на 30 мин.
После этого содержимое удаляют, лунки трехкратно промывают и
подсушивают путем постукивания перевернутым планшетом по
фильтровальной бумаге.
3.7. Готовят раствор n6 по п.2.3.6. Во все лунки планшета
вносят по 0,1 куб.см раствора n 6 - субстратно-индикаторную смесь и
оставляют при комнатной температуре в темном месте на 10-15
минут.
3.8. Выявление специфических антител можно проводить и без
раститровки испытуемых сывороток. В этом случае вначале проводят
раститровку контрольных образцов сывороток: положительной и
отрицательной.
Предварительно в лунки планшета от В11-В12 до h11-h12
вносят по 0,1 куб.см раствора n 1, а затем в лунки А11 и А12 вносят
по О,2 куб.см соответственно положительной и отрицательной
сывороток в разведении 1:200 и проводят двукратную раститровку
контрольных сывороткой из набора по вертикальным рядам от 1:200
до 1:25600, удаляя из последних лунок по 0,1 куб.см содержимого.
Для визуального и спектрофотометрического учета результатов
реакции образцы исследуемых (испытуемых) проб сывороток крови
берут в разведении 1:200 и вносят по 0,1 куб.см в свободные лунки
планшета, используя по одной лунке на каждую пробу.
Остальные этапы постановки анализа проводят аналогично
п.п. 3.5., 3.6., 3.7.
3.9. При спектрофотометрическом учете результатов анализа
во все лунки планшета для остановки реакции необходимо внести по
0,05 куб.см "стоп-реагента", представляющего собой 0.5 М раствор
серной кислоты (2 куб.см h sО, + 18,0 дистиллированной Н О ).
2 4 2
4. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
4.1. Учет результатов анализа проводят через 10-15 мин
одним из способов: визуально - по интенсивности окрашивания
содержимого лунок планшета или инструментально - с помощью
спектофотометра с вертикальным лучом света путем измерения
оптической плотности при длине волны 450 нм.
4.2. При визуальной оценке результатов первоначально
проводят учет реакции по контрольным лункам планшета: в лунках с
положительной сывороткой (ряд А11...Н11; лунки ai.bi.ci)
окрашивание должно быть от желтоватого до темно-коричневого
цвета. С разведением положительной сыворотки интенсивность
окрашивания уменьшается. Окрашивание содержимого лунок с отрица-
тельной сывороткой и без сыворотки (фоновый контроль) должно
отсутствовать или содержимое может иметь незначительную желтова-
тую окраску (ряд al2...hl2; лунки Д1, el, fi, gt, hi).
Реакция учитывается при правильных показаниях контролей.
Это дает основание считать, что компоненты набора соответствуют
требованиям ТУ и можно приступить к учету реакции с пробами
испытуемых сывороток.
4.3. Визуальный учет результатов основан на сравнении
интенсивности цветной окраски содержимого лунок планшета
(испытуемых проб сывороток крови) с окраской лунок контрольного
положительного образца (вертикальный ряд А11...Н11).
Интенсивность цветной реакции прямо пропорциональна количеству
антител в исследуемых пробах сывороток крови. Чем выше
интенсивность окраски содержимого лунок (от желтоватого до
темно-коричневого), тем выше титр антител в исследуемых пробах.
4.4. При постановке реакции без раститровки испытуемых проб
титр сыворотки определяют по интенсивности окрашивания
содержимого лунок (испытуемые сыворотки) в сравнении с
интенсивностью окрашивания положительной контрольной сыворотки
(ряд all... Н11), которая является как бы колибровочной шкалой
для оценки результатов.
В случае необходимости точного определения титра сыворотки
ее раститровывают как указано в п.3.4.
4.5. Раститровка проб испытуемых сывороток крови дает
возможность количественно оценивать титр специфических антител.
За титр испытуемой сыворотки крови принимают ее последнее
разведение, при котором наблюдают видимое глазом цветное
окрашивание содержимого лунок, более интенсивное по сравнению с
окрашиванием содержимого отрицательного контроля.
Положительными считаются пробы сывороток, имеющих окраску
разной степени интенсивности, содержимое которых сравнимо с
окраской положительной контрольной сыворотки (лунки планшета
all... h11).
Отрицательными считаются пробы сывороток, не изменивших
окраску или имеющих незначительное желтоватое окрашивание,
сравнимое с окрашиванием отрицательной контрольной сыворотки
(лунки планшета А12. . .h12).
4. 6. Инструментальный - спектрофотометрический - учет
результатов анализа позволяет количественно оценить титры
специфических антител в исследуемых пробах путем измерений
оптической плотности (ОП) при длине волны 450 нм с одновременной
записью результатов с каждой лунки планшета на листе бумаги или
специальной бумажной ленте.
4. 7. При спектрофотометрическом учете результата оптической
плотности выражают в оптических единицах.
О результатах реакции судят по коэффициенту соотношений
между показаниями оптических плотностей исследуемых проб
сывороток к татсовым контрольного образца.
Для положительной реакции коэффициент соотношений должен
превышать более чем в 2, 1 раза оптическую плотность
отрицательного контроля, что свидетельствует о выявлении
специфических антител к вирусу ИББ птиц в исследуемой пробе.
Для отрицательной реакции коэффициент соотношений между
показаниями оптических плотностей должен быть меньше 2,0, что
свидетельствует об отсутствии специфических антител в
исследуемой пробе сыворотки.
Если коэффициент соотношений оптических плотностей равен
2,О, то реакция оценивается как сомнительная, а испытуемая проба
сыворотки крови подлежит повторному исследованию, и при
подтверждении первоначального результата считается положительной.
5. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
5. 1. Обнаружение специфических антител в исследуемых пробах
сывороток в титре от 1:200 и выше у 50 и более процентов
птицепоголовья, где не проводится специфическая профилактика
против ИББ птиц, является диагностическим титром и свидетельст-
вует о циркуляции (персистенции) полевого вируса ИББ и неблаго-
получии птицехозяйства по указанному заболеванию. В этом случае
положительные сыворотки раститровывают и при выявлении титров
антител 1:800 и выше проводят выделение вируса инфекционной
бурсальной болезни и его идентификацию.
5.2. Раститровка парных проб сывороток крови и выявление не
менее чем 4-кратного прироста антител у 50 и более процентов
исследуемых проб дает основание для постановки диагноза на ИББ
птиц.
Если прирост титра антител в исследуемых пробах не достиг
четырехкратного значения или выявлен менее, чем в 50% случаев,
то это является основанием для проведения дополнительных
вирусологических исследований.
5.3. Поствакцинальный иммунитет считают напряженным, если
титр специфических антител к вирусу ИББ птиц 1:400 и выше не
менее, чем у 80% исследованных проб сывороток крови. Если
результаты контроля неудовлетворительные, то проводят повторные
серологические исследования через 10-14 сут.
6. ГАРАНТИИ ИЗГОТОВИТЕЛЯ
6. 1. Предприятие-изготовитель гарантирует активность
специфических компонентов набора в течение 12 месяцев со дня
изготовления при соблюдении потребителем указанных выше условий
использования диагностического набора и его хранения в сухом
помещении при температуре 4-8 гр. С.
В случае несоответствия компонентов набора требованиям
по активности и специфичности или получения неспецифической
реакции, применение его прекращают и в соответствии с указанием
Главного управления ветеринарии от 08.05.92 г. n 22-7/28 "О
порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного
производства и закупаемые по импорту" направляют рекламацию на
предприятие-изготовитель, во Всероссийский государственный
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и
сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва,
Звенигородское шоссе, 5) и Центральную научно-производственную
ветеринарную лабораторию (ЦНМВЛ, 111162, Москва, ул.
Оранжерейная, 23). При наличии невскрытых наборов 1 набор
упаковывают, опечатывают и направляют с нарочным или почтой во
ВГНКИ ветпрепаратов.
Наставление разработано Всероссийским научно-исследователь-
ским ветеринарным институтом птицеводства (ВНИВИП).
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 19.06.97г.,
протокол № 3 (000611-ОП)