МИНИСТЕРСТВО 
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА 
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ 
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

08.06.98г. n13-7-2/1271

ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора для определения антител к 
возбудителю эпизоотического лимфангита лошадей 
методом иммуноферментного анализа (в порядке 
широкого производственного испытания до 
01.01.2000г.)

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Набор предназначен для определения специфических антител к возбудителю 
эпизоотического лимфангита в сыворотках крови лошадей, ослов, мулов методом им- 
муноферментного анализа (ИФА). Сущность метода заключается в выявлении комплекса 
антиген-антитело на поверхности лунок полистиролового планшета. Образовавшийся спе- 
цифический комплекс взаимодействует с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом 
против igg лошади и вызывает разложение субстрата, окрашивая содержимое лунок план- 
шета.

1.2. Для исследования в лабораторию доставляют не гемолизированные сыворотки 
крови животных (по 0,2-0,3 куб.см). Пробы сывороток хранят в морозильной камере холо- 
дильника при температуре от минус 12 до минус 18°С.

1.3. В состав набора входят 9 компонентов (К1-К9). 
Иммуноспецифические компоненты:

К1- положительная сыворотка крови лошади к возбудителю (грибу) cryptococcus 
farciminosus rivolta (положительный контроль), 0,2 куб.см- 1 ампула (сухая мелкопористая 
масса белого или светло-желтого цвета);

К2 - отрицательная сыворотка крови лошади, не содержащая антител к грибу 
cryptococcus farciminosus rivolta, (отрицательный контроль), 0,2 см 3- 1 ампула (сухая мел- 
копористая масса белого или светло-желтого цвета);

КЗ - очищенный антиген гриба cryptococcus farciminosus rivolta, адсорбирован- 
ный по 0,1 куб.см в лунках планшета для ИФА - 2 планшета;

К4 - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против igg лошади, (сухая мел- 
копористая масса белого или светло-желтого цвета), 0,5 куб.см - 2 флакона;

Неспецифические компоненты:

К5 - набор солей (натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрия хлорид) для 
приготовления фосфатно-солевого буферного раствора - 2 шт. во флаконе (порошок или 
таблетка белого цвета);

К6 - набор солей для приготовления субстратного буфера: натрий фосфорнокислый 
двузамещенный - 5,37 г - 1 флакон (К6.1), лимонная кислота-1,57 г-1 флакон (К6.2);

К7 - детергент твин-20, вязкая маслянистая жидкость соломенно- желтого цвета -1,0 
куб.см - 1 флакон;

К8 - субстрат - ортофенилендиамин, таблетка или порошок сероватого цвета - 6,0 мг 
- 1 флакон;

К9 - перекись водорода, гидроперит, таблетка белого цвета - 0,5 г - 1шт. в упаковке.

1.4. Ампулы, флаконы без этикеток с трещинами, с измененной консистенцией 
подлежат выбраковке.

1.5. Срок годности набора 12 мес со дня его комплектации при условии хранения в 
защищенном от света месте и температуре от 2 до 8 °С.

1.6. Набор рассчитан на проведение 20 анализов сывороток крови лошадей при рас-
титровке сывороток от 1:100 до 1:12800 или 176 анализов при исследовании сывороток в 
одном разведении.

2. Подготовка компонентов набора и оборудования для проведения 
исследований

2.1. Для постановки реакции: одно- и восьмиканальные автоматические пипетки со 
сменными наконечниками, термостат с температурой нагрева (37,0±0,5) °С, бытовой хо- 
лодильник, рН-метр (тип 121 или 340), спектрофотометр с вертикальным лучом.

2.2. Перед приготовлением рабочих растворов набор с компонентами выдерживают 
30 мин при температуре от 18 до 20 °С.

2.3. Раствор №1. Две таблетки К5 растворяют в 1000,0 куб.см дистиллированной воды 
и измеряют рН, которое должно быть в пределах 7,4-7,6. Затем в этот раствор вносят со- 
держимое флакона К7, получая конечную концентрацию детергента Твин-20 - 0,01%. По- 
лученный раствор используют для разведения контрольных сывороток, испытуемых проб, 
антивидового конъюгата и межэтапной промывки. Раствор №1 хранят не более 20 сут при 
температуре 4°С.

2.4. Раствор №2. Содержимое флаконов К6.1 и К6.2 растворяют в отдельных емкостях 
в 50,0 куб.см дистиллированной воды, затем смешивают 24,3 куб.см раствора К6.1 с 25,7 куб.см 
раствора К6.2 и добавляют 50,0 см дистиллированной воды. Полученный раствор должен 
иметь рН 4,9-5,1.

2.5. Раствор №3. Содержимое флакона К 1 растворяют в 0,2 куб.см раствора №1. Раствор 
готовят перед использованием, допускается хранение в течение 3 сут при температуре 4 °С.

2.6. Раствор №4. Содержимое флакона К2 растворяют в 0,2 куб.см раствора №1. Раствор 
№4 готовят перед использованием. Допускается хранение раствора в течение 3 сут при 
температуре 4°С.

2.7. Раствор №5. Содержимое каждого флакона К4 растворяют в 10,0 куб.см раствора 
№1. Каждый флакон рассчитан для титрования на одном планшете. Раствор готовят перед 
использованием. Хранению не подлежит.

2.8. Раствор n6. Таблетку К9 растворяют в куб.20,0 см дистиллированной   воды. Хра- 
нят в защищенном от света месте при температуре 4°С не более 20 сут.

2.9. Раствор №7. Содержимое флакона К8 растворяют в куб.20,0 см раствора №2, встря- 
хивают до полного растворения и добавляют 0,8 куб.см раствора №6. Готовят раствор №7 пе- 
ред использованием. Раствор №7 хранению не подлежит.

3. Постановка реакции

3.1. Из комплекта набора берут планшет (КЗ), в лунках которого адсорбирован 
очищенный антиген и используют для постановки иммуноферментного анализа.

3.2. Разведение сывороток. Образцы исследуемых проб сывороток крови разводят 
1:100 раствором №1. С этой целью к 0,01 куб.см сыворотки крови лошади добавляют 1,0 куб.см 
раствора №1 и перемешивают.

3.3. В лунки рядов планшета В2-В12...Н2-Н12 вносят по 0,1 куб.см раствора №1, в лун- 
ки В 1, С 1 - положительную, а в лунки d1,e1 - отрицательную контрольные сыворотки по 
0,2 куб.см и проводят раститровку по горизонтальным рядам. Из последних лунок В12 - el2 
удаляют по 0,1см3 разведения сывороток. Остальные лунки планшета ( ряды a2-a12,f1-
f12, g1-g12 и Н1-Н12) служат контролем неспецифического связывания конъюгата и суб- 
страта и заполняются по 0,1 куб.см раствора №1.

3.4. Если титр антител в испытуемых пробах превышает 1:12800 то сыворотку тит- 
руют по горизонтальным рядам планшета.

3.5. Планшет осторожно встряхивают, закрывают крышкой и оставляют при 
температуре (4-8 °С) на 18ч. Затем лунки планшета освобождают от содержимого путем 
встряхивания и трехкратно промывают раствором №1.

3.6. Во все лунки планшета вносят по 0,1 куб.см раствора №5, затем помещают в термо- 
стат на (37±0,5 °С) на 1 ч. и промывают четырехкратно.

3.7.Во все лунки вносят по 0,1 куб.см раствора №7. Оставляют при температуре 18-20 °С 
в темном месте 10-15 мин. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку по 0,05 
куб.см раствора серной кислоты, приготовленного путем растворения 2,0 куб.см  концентриро- 
ванной серной кислоты (в наборе отсутствует) в 10,0 куб.см дистиллированной воды.

3.8. Выявление специфических антител в сыворотках крови можно проводить и без 
раститровки испытуемых сывороток. В этом случае во все лунки планшета А2-А12... Н2-
Н 12 вносят по 0,1 куб.см исследуемых проб сывороток в разведении 1:400, используя по 1 
лунке на каждую пробу. В три лунки вертикального ряда al, bl, c1 вносят положитель- 
ные, в три следующие Д1, el, f1 - отрицательные контрольные сыворотки в разведении 
1:400, а лунки gl, hi служат контролем конъюгата и заполняются по 0,1 куб.см раствора 
№1. Остальные этапы проводят по п.3.5,3.6,3.7.

4. Учет результатов реакции

4.1. Учет результатов анализа проводят после остановки реакции с помощью спек- 
трофотометра с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

4.2. Инструментальный фотометрический учет результатов анализа позволяет коли- 
чественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерения 
значений оптической плотности (ОП 492 нм). Животные считаются инфицированными, ес- 
ли величина оптической плотности конечного разведения испытуемой сыворотки в 2,0-2,1 
раза превышает таковую последнего разведения отрицательного контроля.

5. Порядок предъявления рекламаций

В случае несоответствия набора требованиям, указанным в настоящем наставлении, 
применение данной серии препарата прекращают и, в соответствии с указанием Главного 
управления ветеринарии Минсельхозпрода России от 8 мая 1992 г. № 22-7/28 "О порядке 
предъявления рекламаций на ветеринарные препараты отечественного производства и за- 
купаемые по импорту", сообщают об этом предприятию-изготовителю, Всероссийскому 
государственному научно-исследовательскому институту контроля, стандартизации и 
сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, 
ВГНКИ) и Центральной научно-производственной ветеринарной лаборатории (116622, 
Москва, Перовский район, ул. Оранжерейная, 23, ЦНПВЛ). В адрес института высылается 
один невскрытый набор с сопроводительным письмом.

Наставление разработано Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты жи-
вотных (ВНИИЗЖ).

Начальник отдела ветсанэкспертизы 
и лабораторной работы                                         В.И.Белоусов

Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 17.12.1997 года, протокол № 5. 
№ 000579-ОП.