МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Минсельхозпрод России) ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ 08.06.98г. n13-7-2/1271 ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ по применению набора для определения антител к возбудителю эпизоотического лимфангита лошадей методом иммуноферментного анализа (в порядке широкого производственного испытания до 01.01.2000г.) 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Набор предназначен для определения специфических антител к возбудителю эпизоотического лимфангита в сыворотках крови лошадей, ослов, мулов методом им- муноферментного анализа (ИФА). Сущность метода заключается в выявлении комплекса антиген-антитело на поверхности лунок полистиролового планшета. Образовавшийся спе- цифический комплекс взаимодействует с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом против igg лошади и вызывает разложение субстрата, окрашивая содержимое лунок план- шета. 1.2. Для исследования в лабораторию доставляют не гемолизированные сыворотки крови животных (по 0,2-0,3 куб.см). Пробы сывороток хранят в морозильной камере холо- дильника при температуре от минус 12 до минус 18°С. 1.3. В состав набора входят 9 компонентов (К1-К9). Иммуноспецифические компоненты: К1- положительная сыворотка крови лошади к возбудителю (грибу) cryptococcus farciminosus rivolta (положительный контроль), 0,2 куб.см- 1 ампула (сухая мелкопористая масса белого или светло-желтого цвета); К2 - отрицательная сыворотка крови лошади, не содержащая антител к грибу cryptococcus farciminosus rivolta, (отрицательный контроль), 0,2 см 3- 1 ампула (сухая мел- копористая масса белого или светло-желтого цвета); КЗ - очищенный антиген гриба cryptococcus farciminosus rivolta, адсорбирован- ный по 0,1 куб.см в лунках планшета для ИФА - 2 планшета; К4 - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против igg лошади, (сухая мел- копористая масса белого или светло-желтого цвета), 0,5 куб.см - 2 флакона; Неспецифические компоненты: К5 - набор солей (натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрия хлорид) для приготовления фосфатно-солевого буферного раствора - 2 шт. во флаконе (порошок или таблетка белого цвета); К6 - набор солей для приготовления субстратного буфера: натрий фосфорнокислый двузамещенный - 5,37 г - 1 флакон (К6.1), лимонная кислота-1,57 г-1 флакон (К6.2); К7 - детергент твин-20, вязкая маслянистая жидкость соломенно- желтого цвета -1,0 куб.см - 1 флакон; К8 - субстрат - ортофенилендиамин, таблетка или порошок сероватого цвета - 6,0 мг - 1 флакон; К9 - перекись водорода, гидроперит, таблетка белого цвета - 0,5 г - 1шт. в упаковке. 1.4. Ампулы, флаконы без этикеток с трещинами, с измененной консистенцией подлежат выбраковке. 1.5. Срок годности набора 12 мес со дня его комплектации при условии хранения в защищенном от света месте и температуре от 2 до 8 °С. 1.6. Набор рассчитан на проведение 20 анализов сывороток крови лошадей при рас- титровке сывороток от 1:100 до 1:12800 или 176 анализов при исследовании сывороток в одном разведении. 2. Подготовка компонентов набора и оборудования для проведения исследований 2.1. Для постановки реакции: одно- и восьмиканальные автоматические пипетки со сменными наконечниками, термостат с температурой нагрева (37,0±0,5) °С, бытовой хо- лодильник, рН-метр (тип 121 или 340), спектрофотометр с вертикальным лучом. 2.2. Перед приготовлением рабочих растворов набор с компонентами выдерживают 30 мин при температуре от 18 до 20 °С. 2.3. Раствор №1. Две таблетки К5 растворяют в 1000,0 куб.см дистиллированной воды и измеряют рН, которое должно быть в пределах 7,4-7,6. Затем в этот раствор вносят со- держимое флакона К7, получая конечную концентрацию детергента Твин-20 - 0,01%. По- лученный раствор используют для разведения контрольных сывороток, испытуемых проб, антивидового конъюгата и межэтапной промывки. Раствор №1 хранят не более 20 сут при температуре 4°С. 2.4. Раствор №2. Содержимое флаконов К6.1 и К6.2 растворяют в отдельных емкостях в 50,0 куб.см дистиллированной воды, затем смешивают 24,3 куб.см раствора К6.1 с 25,7 куб.см раствора К6.2 и добавляют 50,0 см дистиллированной воды. Полученный раствор должен иметь рН 4,9-5,1. 2.5. Раствор №3. Содержимое флакона К 1 растворяют в 0,2 куб.см раствора №1. Раствор готовят перед использованием, допускается хранение в течение 3 сут при температуре 4 °С. 2.6. Раствор №4. Содержимое флакона К2 растворяют в 0,2 куб.см раствора №1. Раствор №4 готовят перед использованием. Допускается хранение раствора в течение 3 сут при температуре 4°С. 2.7. Раствор №5. Содержимое каждого флакона К4 растворяют в 10,0 куб.см раствора №1. Каждый флакон рассчитан для титрования на одном планшете. Раствор готовят перед использованием. Хранению не подлежит. 2.8. Раствор n6. Таблетку К9 растворяют в куб.20,0 см дистиллированной воды. Хра- нят в защищенном от света месте при температуре 4°С не более 20 сут. 2.9. Раствор №7. Содержимое флакона К8 растворяют в куб.20,0 см раствора №2, встря- хивают до полного растворения и добавляют 0,8 куб.см раствора №6. Готовят раствор №7 пе- ред использованием. Раствор №7 хранению не подлежит. 3. Постановка реакции 3.1. Из комплекта набора берут планшет (КЗ), в лунках которого адсорбирован очищенный антиген и используют для постановки иммуноферментного анализа. 3.2. Разведение сывороток. Образцы исследуемых проб сывороток крови разводят 1:100 раствором №1. С этой целью к 0,01 куб.см сыворотки крови лошади добавляют 1,0 куб.см раствора №1 и перемешивают. 3.3. В лунки рядов планшета В2-В12...Н2-Н12 вносят по 0,1 куб.см раствора №1, в лун- ки В 1, С 1 - положительную, а в лунки d1,e1 - отрицательную контрольные сыворотки по 0,2 куб.см и проводят раститровку по горизонтальным рядам. Из последних лунок В12 - el2 удаляют по 0,1см3 разведения сывороток. Остальные лунки планшета ( ряды a2-a12,f1- f12, g1-g12 и Н1-Н12) служат контролем неспецифического связывания конъюгата и суб- страта и заполняются по 0,1 куб.см раствора №1. 3.4. Если титр антител в испытуемых пробах превышает 1:12800 то сыворотку тит- руют по горизонтальным рядам планшета. 3.5. Планшет осторожно встряхивают, закрывают крышкой и оставляют при температуре (4-8 °С) на 18ч. Затем лунки планшета освобождают от содержимого путем встряхивания и трехкратно промывают раствором №1. 3.6. Во все лунки планшета вносят по 0,1 куб.см раствора №5, затем помещают в термо- стат на (37±0,5 °С) на 1 ч. и промывают четырехкратно. 3.7.Во все лунки вносят по 0,1 куб.см раствора №7. Оставляют при температуре 18-20 °С в темном месте 10-15 мин. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку по 0,05 куб.см раствора серной кислоты, приготовленного путем растворения 2,0 куб.см концентриро- ванной серной кислоты (в наборе отсутствует) в 10,0 куб.см дистиллированной воды. 3.8. Выявление специфических антител в сыворотках крови можно проводить и без раститровки испытуемых сывороток. В этом случае во все лунки планшета А2-А12... Н2- Н 12 вносят по 0,1 куб.см исследуемых проб сывороток в разведении 1:400, используя по 1 лунке на каждую пробу. В три лунки вертикального ряда al, bl, c1 вносят положитель- ные, в три следующие Д1, el, f1 - отрицательные контрольные сыворотки в разведении 1:400, а лунки gl, hi служат контролем конъюгата и заполняются по 0,1 куб.см раствора №1. Остальные этапы проводят по п.3.5,3.6,3.7. 4. Учет результатов реакции 4.1. Учет результатов анализа проводят после остановки реакции с помощью спек- трофотометра с вертикальным лучом при длине волны 492 нм. 4.2. Инструментальный фотометрический учет результатов анализа позволяет коли- чественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерения значений оптической плотности (ОП 492 нм). Животные считаются инфицированными, ес- ли величина оптической плотности конечного разведения испытуемой сыворотки в 2,0-2,1 раза превышает таковую последнего разведения отрицательного контроля. 5. Порядок предъявления рекламаций В случае несоответствия набора требованиям, указанным в настоящем наставлении, применение данной серии препарата прекращают и, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Минсельхозпрода России от 8 мая 1992 г. № 22-7/28 "О порядке предъявления рекламаций на ветеринарные препараты отечественного производства и за- купаемые по импорту", сообщают об этом предприятию-изготовителю, Всероссийскому государственному научно-исследовательскому институту контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ) и Центральной научно-производственной ветеринарной лаборатории (116622, Москва, Перовский район, ул. Оранжерейная, 23, ЦНПВЛ). В адрес института высылается один невскрытый набор с сопроводительным письмом. Наставление разработано Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты жи- вотных (ВНИИЗЖ). Начальник отдела ветсанэкспертизы и лабораторной работы В.И.Белоусов Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 17.12.1997 года, протокол № 5. № 000579-ОП.