МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод РФ)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
15.06.98г. n13-7-2/1280
ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора реагентов для
выявления антител
к вирусу классической чумы свиней
иммуноферментным методом
«КЧС-СЕРОТЕСТ»
(в порядке широкого производственного
испытания до 01.01. 2000 гг.)
1.ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Назначение набора
Набор реагентов предназначен для выявления антител к вирусу классической чумы свиней
(КЧС) в сыворотке крови иммуноферментным методом с целью диагностики КЧС у не
вакцинированных животных и оценки напряженности иммунитета после вакцинации.
Набор реагентов рассчитан для проведения на одном планшете одновременного
анализа 46 исследуемых (в 2 повторах) и двух контрольных сывороток (в 2 повторах). Компоновка
набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких
серий анализов по мере поступления биоматериала.
Набор хранят при температуре от 2 до 8° С и относительной влажности не более 80 %.
Замораживание ингредиентов комплекта не допускается.
Срок годности набора - 6 мес.
1.2. Состав набора
В состав набора входят:
1. Планшет для иммуноферментного анализа с иммобилизованным рекомбинантным антигеном Е2
вируса КЧС - 1 шт.
2. Положительная сыворотка свиньи (К+) , 0.5 мл -1 фл. (прозрачная или слегка опалесцирующая
жидкость желто-красного цвета).
3. Отрицательная сыворотка свиньи (К-), 0.5 мл - 1 фл. (прозрачная или слегка опалесцирующая
жидкость желто-красного цвета).
4. 20-ти кратный концентрат фосфатно-солевого буфера с Твином 20 для промывки планшетов
(ФСБТ), 50 мл - 1 фл.
5. Буфер для разведения сывороток (БР), 10 мл -1 фл.
6. Конъюгат моноклональных антител к вирусу КЧС с пероксидазой хрена (Конъюгат), 10 мл - 1 фл
(прозрачная жидкость розового цвета).
7. Субстратный раствор с перекисью водорода для разведения хромогена (СР), 8 мл. -1 фл.
8. Хромоген, тетраметилбензидин (ТМБ), 2 мл. - 1 фл.
9.1 n Серная кислота (Стоп-раствор), 10 мл - 1 фл.
1.3. Упаковка и маркировка
На флаконы с каждым компонентом наклеивают или наносят несмываемой краской по стеклу
этикетки с указанием краткого названия компонента, количества препарата во флаконе, номера серии,
срока годности (месяц, год). Этикетированные флаконы укладывают в коробки и в таком виде они
представляют набор компонентов для выявления антител к вирусу классической чумы свиней.
На каждую коробку с набором реагентов наклеивают этикетку, в которой указывают: наименование и
товарный знак предприятия-изготовителя, полное название набора, перечень компонентов, входящих в
набор, количество флаконов, рабочее разведение, номер серии набора, номер контроля, дату
изготовления набора (месяц, год), срок годности, условия хранения и обозначение ТУ. В каждую
коробку с набором реагентов вкладывают временное наставление по применению.
Примечание: В наборе содержатся все необходимые для проведения анализа реактивы, за
исключением дистиллированной воды. В качестве дополнительного оборудования необходимы
микропипетки вместимостью 10, 100, 200 и 1000 мкл, мерная лабораторная посуда, суховоздушный
термостат с температурой 37°С, спектрофотометр с длинной волны 450 нм.
ВНИМАНИЕ. Буферные растворы и стандарты содержат токсические консерванты -
мертиолят и азид натрия. Не допускайте попадания их внутрь и на слизистые оболочки. Серная
кислота вызывает раздражение при попадании на кожу и слизистые оболочки.
2. ПРИНЦИП МЕТОДА
2.1.Метод основан на конкурентном взаимодействии конъюгированных с пероксидазой
моноклональных антител к оболочечному белку Е2 вируса КЧС и сывороточных вирусспецифических
антител с иммобилизованным на поверхности иммунологического планшета рекомбинантным белком
Е2. При отсутствии в исследуемой сыворотке вирусспецифических антител, моноклональный
конъюгат свободно взаимодействует с иммобилизованным Е2 и после добавления субстрата и
хромогена в лунке развивается окраска. Если исследуемая сыворотка содержит вирусспецифические
антитела, происходит их взаимодействие с иммобилизованным Е2, его частичная или полная
блокировка, в результате чего связывание конъюгата с антигеном и, соответственно, интенсивность
окраски снижается. Таким образом, интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству
антител в исследуемой сыворотке.
3.ПОДГОТОВКА КОМПОНЕНТОВ
3.1 Подготовка биологического материала
Для анализа используют сыворотку крови. Образцы биоматериала хранят при
температуре 4°С, если анализ проводят не позднее 24 ч после отбора. Для более длительного
хранения образцы замораживают и хранят при минус 20°С. Замороженные образцы перед
исследованием быстро (в течение 5-10 мин) размораживают нагреванием в водяной бане при
температуре 37°С для предотвращения осаждения фибриногена. В случае выпадения осадка пробы
обязательно осветляют центрифугированием 10 мин при 2000g. Многократное замораживание и
оттаивание образцов не допускается.
3.2. Подготовка рабочих растворов
3.2.1. Перед началом работы все реагенты выдерживают не менее 0.5 ч при комнатной (18-25° С)
температуре.
3.2.2.Рабочий раствор буфера для отмывания планшетов ФСБТ. Содержимое флакона № 4
разводят в 20 раз свежеприготовленной дистиллированной водой. Пример: к 20 мл концентрата
добавляют 380 мл воды. При необходимости использования части компонентов следует иметь ввиду,
что для обработки одного стрипа требуется примерно 20 мл рабочего раствора. Готовый рабочий
раствор стабилен при температуре 4 гр.С в течение 7 сут.
3.2.3. Рабочий хромоген-субстратный раствор. Раствор хромогена ( ТМБ - флакон №8 ) разводят
субстратным раствором (СР, флакон №7) в соотношении 1 к 4 и перемешивают. Пример: к 1 мл
раствора ТМБ добавляют 4 мл субстратного раствора. Раствор готовят непосредственно перед
использованием.
Буфер для разведения сыворотки (БР) №5
Положительная сыворотка (К+)
Отрицательная сыворотка (К-)
Раствор конъюгата (Конъюгат)
Стоп-раствор (1 n Серная кислота) - готовы к употреблению
ВНИМАНИЕ. В случае появления осадка или помутнения в растворах контрольных сывороток, их
осветляют центрифугированием 10 мин при 2000g. Все исходные компоненты набора стабильны до
истечения срока годности. Оставшиеся после частичного использования компоненты должны
храниться плотно закрытыми в заводской упаковке. Не переливать в другую посуду! Не смешивать
компоненты из наборов разных серий!
4. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
4.1. Проведение анализа
4.1.1. В лунки планшета вносят по 0.075 мл БР (из расчета по две лунки на каждый образец
сыворотки и по 2 лунки для положительных и отрицательных контролей).
4.1.2. В лунки А1-В1 вносят по 0.05 мл К+.
4.1.3.В лунки c1-d1 вносят по 0.05 мл К-.
4.1.4. В остальные лунки планшета с буфером БР вносят по 0.05 мл исследуемой сыворотки (по две
лунки на каждый образец сыворотки).
4.1.5. Закрывают планшет липкой пленкой и инкубируют 1.5 час при температуре 18 - 22°С.
4.1.6. Планшет 5 раз промывают буфером ФСБТ (300 мкл/лунку), каждый раз полностью удаляя
жидкость из лунок постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.
ВНИМАНИЕ. При этой операции возможно выпадение стрипов из рамки! Рекомендуется
отмаркировать каждый стрип для восстановления их первоначального расположения.
4.1.7. В каждую лунку добавляют по 0.1 мл раствора конъюгата.
4.1.8. Планшет закрывают липкой пленкой и инкубируют 45 мин при 37°С.
4.1.9. Планшет 5 раз промывают буфером ФСБТ (из расчета 300 мкл/лунку), каждый раз полностью
удаляя жидкость из лунок путем постукивания перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.
4.1.10. Добавляют в каждую лунку по 0.1 мл рабочего хромоген-субстратного раствора.
4.1.11. Планшет инкубируют в темноте 20 мин при температуре 18-22 гр.С.
4.1.12.0станавливают реакцию добавлением 0.1 мл стоп-раствора (1n h s0 ).
2 4
4.1.13. После остановки реакции оптическую плотность субстратной смеси измеряют на
спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 450 нм (А450).
4.2. Учет и интерпретация результатов
4.2.1. Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (А45о)для всех проб К+
(А450 К+ ср.).
4.2.2.Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности (А45о)для всех проб К-
(А450 К-ср.).
4.2.3. Вычисляют среднее значение оптической плотности (А45о) для каждой опытной пробы (ОП)
(А450 ОПср.).
4.2.4. Вычисляют коэффициент ингибирования (Кинг) связывания конъюгата сывороточными
антителами по формуле:
(А450 К-ср. - А450 ОПср.)
Кинг = ----------------------------- х 100
(А450 К-ср. - А450 К+ ср.)
ВНИМАНИЕ. Величина (А450 К-ср. - А450 К+ср.) является характеристикой работоспособности
набора и должна составлять не менее 0.3. Если эта величина менее 0.3, к полученным результатам
следует относиться как к сомнительным и, по возможности, повторить анализ.
Пробу считают отрицательной, если величина Кинг менее 50%.
Если величина Кинг более 50% пробу считают положительной.
Если в сыворотке невакцинированного животного (исключая невакцинированных поросят
от вакцинированных свиноматок, которые имеют колостральный иммунитет до 60-ти дневного
возраста) обнаруживают антитела к вирусу КЧС (Кинг выше 50%), это свидетельствует о контакте с
вирусом и возможном заболевании.
При исследовании напряженности поствакцинального иммунитета результаты
рекомендуется интерпретировать в соответствии с таблицей 1.
Табл.1
Соотношение между Кинг, титром антител в реакции нейтрализации (РН) и
напряженностью иммунитета
Коэффициент ингибирования Титр антител в РН Иммунитет
<50% <1/20 Отсутствует
50 -70% 1/20-1/80 Слабый
70 -80% 1/40 - 1/320 Умеренно выраженный
80-100% 1/160- 1/640 Отчетливо выраженный
>100% >1/320 Максимально выраженный
Необходимо учитывать, что развитие устойчивого гуморального иммунитета начинается на 20 - 25
день после вакцинации, поэтому определение напряженности иммунитета рекомендуется проводить
не ранее 20 дня после вакцинации.
Тем не менее, если Кинг лежит в диапазоне от 50 до 60%, рекомендуется повторить анализ образца,
а также повторно взять кровь от этого же животного через две недели. Если при этом величина Кинг
остается в области 50 - 60% сыворотку следует считать сомнительной. При Кинг выше 60% уровень
вируснейтрализующих антител в сыворотке обеспечивает устойчивость животного к заражению
вирулентным вирусом.
ВНИМАНИЕ. Уровень антител к вирусу КЧС у животных может иметь существенные
индивидуальные отличия. Для получения достоверных результатов, рекомендуется исследовать
группы животных (не менее 10 голов), одинаковых по условиям содержания, возрасту и т.д. Не
используйте объединенные сыворотки от разных животных. В случае сомнительных результатов
рекомендуется повторить анализ тех же образцов сыворотки и применить другие методы анализа
антител (реакцию нейтрализации или цитохимический вариант иммуноферментного анализа).
5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
5.1. Рекламации на качество наборов в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии
"О порядке предъявления рекламаций на ветеринарные препараты отечественного производства и
закупаемые по импорту" №22-7/28 от 8 мая 1992 г. направляют предприятию-изготовителю (НПО
НАРВАК, 123098, Москва, Гамалеи, 16) , Всероссийскому государственному научно-
исследовательскому институту контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов
(ВГНКИ) по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе,5 и в ЦНМВЛ (Москва, Косино,
Оранжерейная, 23). При наличии невскрытых наборов данной серии один набор направляют в
ВГНКИ.
Временное наставление разработано НПО НАРВАК.
Рассмотрено и одобрено Советом по ветеринарным препаратам Департамента
ветеринарии Минсельхозпрода РФ, протокол № 2,14.04.1998г., № 000630-ОП.
Начальник отдела ветеринарно-санитарной экспертизы и лабораторной работы
В.И.Белоусов