МИНИСТЕРСТВО УТВЕРЖДАЮ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Зам.начальника
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии
ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ
n 13-7-2/1242 14 мая 1998 г.
ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы на основе
полимеразной цепной реакции (ПЦР)
для обнаружения вируса чумы плотоядных
(для широкого производственного испытания
до 01.2000 г.)
1. Общие положения
1.1. Тест-система предназначена для обнаружения вируса чумы плотоядных
(ВЧП) в инфицированных культурах клеток и материале от больных животных
(кровь, носовые и конъюнктивальные смывы), в кусочках органов от павших
животных. Набор рассчитан на 100 анализов.
Тест-система для определения РНК вируса чумы плотоядных методом
полимеразной цепной реакции представляет собой набор для выявления ВЧП из
10 компонентов, набор для выделения РНК из 5 компонентов и набор для
проведения электрофореза из 4 компонентов.
1.2. Набор для выявления ВЧП (состоит из 10 компонентов)
1. Раствор термостабильной ДНК-полимеразы ( Таq-полимераза), вязкая
жидкость, с активностью 5 ед/мкл, 50,0 мкл - 1 пробирка (флакон)
2. Раствор мезофильной ревертазы (Аmv-rt или М-Мlv, прозрачная жидкость,
с активностью 10 ед/мкл, 50,0 мкл - 1 пробирка (флакон)
3. Смесь нуклеозидтрифосфатов (dntps), прозрачная жидкость, по 0,75 мл
водного раствора нуклеозидтрифосфатов с концентрацией 2.5 мm каждого - 1
пробирка (флакон).
4. Контрольная неинфекционная РНК штамма ВЧП или ее амплификат,
прозрачная жидкость - 100,0 мкл или 25 мкл амплификата - 1 пробирка (флакон)
5. Смесь праймеров первого раунда (№1) - 0,2 мл водного раствора двух
олигонуклеотидов с концентрацией каждого 10 пмоль/мкл, прозрачная жидкость -
1 проб.(фл.)
6. Смесь праймеров второго раунда (№2) - 0.2 мл водного раствора двух
олигонуклеотидов с концентрацией каждого 10,0 пмоль/мкл, прозрачная
жидкость - 1 проб.(фл.)
7. Буфер реакционный 10-кратный (10xбуфер), прозрачная жидкость -0,8 мл - 1
проб.(фл.)
8. Буфер реакционный 5-кратный (5Хбуфер), прозрачная жидкость - 0,5 мл - 1
проб.(фл.)
9. Демонизованная вода - 5,0 мл воды, деионизованной системой milli q фирмы
Мillipore и обработанной диэтилпирокарбонатом - 5 проб.(фл.)
10. Вазелиновое масло (вязкая жидкость) 8,0 мл - 1 фл.
1.3. Набор для выделения РНК (состоит из 5 компонентов)
11. Раствор №1: 110,0 мл - 1 фл.
12.Раствор №2; 40,0 мл - 1 фл.
13. Раствор №3; 40,0 мл - 1 фл.
14. Раствор №4: 20,0 мл - 1 фл. (р-ры №№1-4 представляют собой прозрачную
жидкость)
15. Сорбент: 4,0 мл водной суспензии сорбента (осадок под слоем жидкости) - 1
фл.
1.4. Набор для проведения электрофореза ( состоит из 4 компонентов)
( на 10 гелей по 10 образцов).
16. Агароза (порошок) - 10,0 г- 1 проб.(фл.)
17. Буфер ТАЕ (трисацетатный), 10-ти кратный раствор прозрачная жидкость,
100,0 мл - 1 фл.
18. Раствор бромистого этидия, прозрачная жидкость, 10,0 мг/мл, 300,0 мкл - 1
проб.(фл.)
19. Буфер для нанесения образца, вязкая жидкость, 0,3 мл - 1 проб.(фл.)
1.5. В каждый пакет с тест-системой вкладывается наставление по применению.
1.6. Флаконы и пробирки с компонентами упаковывают в полиэтиленовые пакеты
с наименованием тест-системы и каждого набора. На пробирках и флаконах с
каждым компонентом должна быть этикетка с указанием краткого названия и
номера компонента.
1.7. На каждый пакет с компонентами наборов тест-системы наклеивают этикетку
с указанием: предприятия-изготовителя и товарного знака, наименования тест-
системы и набора, номера серии и номера контроля, даты изготовления, срока
годности, условий хранения, обозначения номера ТУ.
2. Принцип действия тест-системы
2.1. С помощью данной тест-системы можно определить вирус чумы
плотоядных на ранней стадии заболевания (2-3 дня после заражения). Выделяется
нуклеиновая кислота и с помощью ПЦР амплифицируется специфический
фрагмент вируса чумы плотоядных. Полученный умноженный фрагмент
детектируется с помощью электрофореза в агарозном геле, содержащем
бромистый этидий.
3. Способ применения
3.1. Все манипуляции, связанные с использованием тест-системы ПЦР,
проводятся пипеточными дозаторами типа "Ленпипет" следующих объемов: 0-
20,0 мкл, 20-200,0 мкл, 0-1000,0 мкл с использованием полипропиленовых
пробирок вместимостью 1,5 мл (ПО "Ленполимер") и 0,5 миллилитровых
наконечников к пипеточным дозаторам одноразового использования.
3.2. Выделение вирусной РНК:
Для выделения вирусной РНК необходимо использовать набор для
выделения РНК.
Ватный тампон, содержащий пробу носовых или конъюктивальных смывов,
(или одноразовый шпатель) переносят в пробирку с 500,0 мкл физиологического
раствора. После тщательного перемешивания, тампон отжимают пинцетом,
удаляют и проводят выделение как описано ниже. Исследование крови проводят
без предварительной обработки .
Образцы исследуемого биологического материала (кровь, носовые или
конъюктивальные смывы) в объеме 0,2-0,3 мл помещают в полипропиленовые
пробирки и добавляют 1.1 мл раствора №1. Инкубируют 10 мин при комнатной
температуре при перемешивании. Пробы центрифугируют на центрифуге типа
"Эппендорф" 5 мин при 13000 об/мин, супернатант переносят в чистые пробирки,
а осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют 40,0 мкл сорбента и
инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, 1-2 раза перемешивая
на вортексе. Затем центрифугируют 15 с на микроцентрифуге при 13000 об./мин,
супернатант отбрасывают. К осадку добавляют 0.2 мл раствора №2,
перемешивают на вортексе и осаждают сорбент центрифугированием в течение
15 с. Супернатант отбрасывают. Процедуру промывки осадка раствором №3
повторяют. Дважды промывают осадок сорбента, используя 0,2 мл раствора №3 и
один раз, используя 0,2 мл раствора № 4. Пробы сушат в течение 10-15 мин при
56С, оставляя пробирки открытыми. К пробам добавляют по 30 мкл
деионизованной воды, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 10-15
мин при 56c, в закрытых пробирках. После этого пробы центрифугируют 1 мин
при 13000 об./мин и водную фазу используют для проведения ПЦР.
ВНИМАНИЕ; На всех стадиях обработки биоматериала, удаление
супернатанта производить одноразовыми пластиковыми наконечниками при
помощи водоструйного насоса в колбу-ловушку, содержащую дезинфицирующий
раствор (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т. п.) со временем экспозиции
не менее 15 мин.
3.3. Синтез кДНК.
В пробирку вместимостью 0,5 мл вносят 5,0 мкл раствора №8, добавляют 2,5
мкл раствора №3, по 1,0 мкл растворов №5 и №6, 0,5 мкл раствора №2, 10,0 мкл
выделенной РНК и затем раствором №9 доводят до конечного объема 25,0 мкл.
Инкубируют в термостате при 37С в течение 60 мин. Реакцию останавливают
инкубацией 10-15 мин при минус 70c. Для проведения последующей ПЦР
используют 5 мкл полученного раствора ДНК.
3.4. Проведение первого раунда полимеразной цепной реакции.
В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в
исследуемой пробе при температуре 94 гр.С, гибридизации (отжига) с исследуемой
ДНК специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) при температуре
53 гр.С и синтез с них комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной
ДНК-полимеразы при температуре 72 гр.С.
В результате проведения 25 циклов амплификации, концентрация
синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллиарды
раз, что позволяет учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в
агарозном геле.
В пробирку объемом 1,5 мл вносят следующие компоненты набора для выявления
вируса чумы плотоядных:
1-ти кратный буфер - 4,0 мкл
dntps - 2,5 мкл
смесь праймеров №1 - 1,0 мкл
ДНК-полимераза - 0,25 мкл
деионизованная вода - до 25,0 мкл
кДНК -5,Омкл
Перемешивают, все капли собирают центрифугированием в течение 5-10 сек.
На поверхность водной фазы осторожно наносят 40,0 мкл ( 2-3 капли )
вазелинового масла. Пробы амплифицируют на амплификаторе "Биотерм".
Программа амплификации:
94С - 2 мин
53С - 1 мин 1 цикл
72c - 2 мин
94С - 0.5 мин
53С - 0.5 мин 23 цикла
72С - 0.5 мин
94С - 2 мин
53С - 1 мин 1цикл
72С - 5 мин
3.5. Проведение второго раунда полимеразной цепной реакции (реамплификация)
Все процедуры проводят так же как описано в п. 3.4. со следующими
изменениями:
- используют смесь праймеров №2
- вместо кДНК используют продукт реакции ПЦР первого раунда-также 5,0 мкл.
- проводят 36 циклов реамплификации
3.6. Контроли - положительный и отрицательный
В каждой серии анализов ставят два контрольных образца: К+
(положительный) - 10,0 мкл контрольной РНК, входящей в состав тест-системы
(раствор №4) и К- (отрицательный) - 10,0 мкл деионизованной воды. Смеси для
контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемого
образца. Отрицательный образец готовят в первую очередь, положительный - в
последнюю, чтобы избежать контаминации исследуемых проб.
3.7. Учет результатов амплификации
Результаты исследования учитываются путем анализа продуктов
амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле.
3.7.1. Приготовление буфера для электрофореза
Для приготовления 1,0 л буфера для электрофореза к 100 мл 10-ти кратного ТАЕ
буфера добавляют 900,0 мл дистиллированной воды. Буфер можно приготовить
самостоятельно, по следующей прописи: навеску 4,04 г Триса
(гидроксиламинометана) растворяют в 200,0 мл дистиллированной воды,
добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2,0 мл 0,5 М раствора ЭДТА рН
8.0 и доводят объем буфера до 1000,0 мл дистиллированной водой.
3.7.2. Приготовление агарозного геля
К 100,0 мл 2%-ной суспензии агарозы в буфере для электрофореза добавляют
10,0 мкл раствора № 18, доводят до кипения и охлаждают до 45С. Заливают в
специальную форму с гребенкой и дают затвердеть. Гребенку осторожно
вынимают и форму с агарозой переносят в аппарат для горизонтального
электрофореза (ПГ-9 "Диа - М") и погружают в буфер.
3.7.3. Электрофорез продуктов амплификации
К 7,0 мкл полученной амплификационной смеси (водной фазы) добавляют 1,0-1,5
мкл буфера для нанесения (раствор №19), перемешивают пипетированием и
полученный образец вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов
гребенки.
Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/см длины геля, в течение 60
мин. За это время краситель успевает пройти не менее половины геля.
Направление движения образцов в геле от "-" к "+"!
3.7.4. Учет результатов электрофореза
Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длиной волны
254 нм на приборе "Трансиллюминатор". Результаты реакции выявляются в виде
светящихся красноватых полос. Положительными (т. е. содержащими вирус чумы
плотоядных) считаются пробы, в которых полосы в геле располагаются точно на
таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля.
Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких
полос, или они не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе
(располагаются на другом расстоянии от старта ).
Документирование полученных результатов проводят при помощи
фотографирования гелей в ультрафиолетовом свете с использованием оранжевого
светофильтра (например, на фотопленке Микрат - 300 аппаратом типа "Зенит").
Предложенный метод целесообразно использовать при комплексной диагностике
на чуму плотоядных.
4. Необходимые условия успешного проведения анализа
4.1. Строгое соблюдение условий хранения компонентов тест-системы.
4.2. Однократное использование наконечников и пробирок. Ранее
использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя!
4.3. При составлении смеси для амплификации, вначале готовить
отрицательный контроль, а последним - положительный контроль.
4.4. Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой
или тщательно обработана хромпиком и отмыта.
5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
Рекламации на качество данной тест-системы в соответствии с указанием
Главного управления ветеринарии №22-7/28 от 8 мая 1992 года "О порядке
предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и
закупаемые по импорту" направляют предприятию-изготовителю (123098, Москва,
ул. Гамалеи.16, НПО НАРВАК), во Всероссийский Государственный научно-
исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации
ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022, Москва, Звенигородское
шоссе, 5. и ЦНПВЛ (Москва, Косино, Оранжерейная, 23). При наличии
невскрытых наборов с препаратами данной серии один набор направляют в
ВГНКИ.
Временное наставление разработано НПО НАРВАК, рассмотрено и одобрено
на заседании Совета по ветеринарным препаратам при Департаменте ветеринарии
Минсельхозпрода РФ, 12.02.1998 г., протокол № 1, № 000601