НАСТАВЛЕНИЕ

МИНИСТЕРСТВО УТВЕРЖДАЮ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Зам.начальника
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии

ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ

n 13-7-2/1240 14 мая 1998 г.

ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора для выявления
антигена парвовирусного энтерита собак,
вирусного энтерита норок и панлейкопении
кошек иммуноферментным анализом (ИФА)
(для широкого производственного
испытания до 01.2000 г.)

1.ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Набор предназначен для выявления специфического антигена вирусного
энтерита собак, вирусного энтерита норок и панлейкопении кошек
иммуноферментным анализом в материале от больных и экспериментально
зараженных животных.

1.2. Компоненты набора выпускают в закрытых флаконах (ампулах). На ампулы и
флаконы с каждым компонентом наклеивают или наносят несмываемой краской
по стеклу этикетки с указанием для специфических антигенов
(иммуноглобулинов, пероксидазных конъюгатов и т.д.) - краткое название
компонента количество препарата в ампуле/флаконе, номера серии и даты
изготовления.

1.3. Этикетированные ампулы и флаконы укладывают в коробки и в таком виде
они представляют диагностический набор. На каждую коробку с диагностическим
набором наклеивают этикетку, в которой указывают: наименование и товарный
знак предприятия-изготовителя, полное название набора, перечень компонентов,
входящих в набор, количество ампул/флаконов, рабочее разведение, номер
серии набора, номер контроля, дату изготовления (месяц и год), срок годности,
условия хранения и обозначение номера ТУ.

1.3. Диагностический набор транспортируют и хранят при температуре от 2 до 8°
С. Не допускается хранение при минусовой температуре.

1.4. Срок годности набора - 6 мес. со дня изготовления.

2. СОСТАВ НАБОРА

2.1. В состав набора входят Специфические компоненты (в виде сухой
гомогенной аморфной массы):

1. Специфический моноклональный иммуноглобулин g (lgg)
лиофилизированный (белый) - 1 ампула (флакон); 0,1 мл. Используется
для сенсибилизации полистироловых планшетов.

2. Специфический антиген парвовирусного энтерита собак (ПЭС)
лиофилизированный (светло-желтый) - 1 ампула (флакон); 1,0 мл.
Используется в качестве положительного контроля.

3. Лизат клеток без вируса энтерита собак лиофилизированный (светло-
желтый или розовый) - 1 ампула (флакон); 1,0 мл. Используется в
качестве отрицательного контроля.

4. Специфический поликлональный (моноклональный) иммуноглобулин g,
конъюгированный с пероксидазой хрена: пероксидазный конъюгат (ПХ-кон.)
лиофилизированный (светло-желтый) - 1 ампула (флакон); 0,1 мл.
Используется для выявления комплекса антиген - антитело.

Неспецифические компоненты (прозрачные бесцветные жидкости):

5. 1М карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) рН 9,4-9,6 - 1 флакон; 1,3 мл.

6. 1М фосфатно-буферный раствор (ФБР), рН 7,2-7,4 - 1 флакон; 6 мл.

7. Натрий хлористый - 1 флакон; 5,1г.

8. Твин-20 - 1 флакон; 0,6 мл.

9. Бычий сывороточный альбумин (БСА)*(белый кристаллический порошок) -
1 флакон; 1,0 г.

10. Концентрат фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ) с перекисью водорода**-
1 таблетка (либо жидкий) - 1 флакон.

11. Ортофенилендиамин (ОФД)** -субстрат - 1 флакон; 1 таблетка (5 мг).

12. Плоскодонный полистироловый планшет 96-ти луночный - 1шт.

13. Буфер-стабилизатор - буфер для разведения конъюгата - 1 флакон, по
10,0 мл .

14. Наставление на набор - 1.

* БСА (компонент № 9) может быть заменен на другой инертный белок
(сухое обезжиренное молоко, яичный альбумин и др.).

** Вместо ФЦБ М5 10 и субстрата ОФД n11 может вкладываться другой
субстрат - 3,3',5,5' - тетраметилбензидин (ТМБ) - 1 флакон, 10,0 мл.

2.2. Набор рассчитан на проведение 45 анализов при скрининге, т.е. в двух
повторах и 11 - при титровании проб с разведения от 1:2 до 1:256, а так же может
быть использован для работы с небольшим количеством проб 1,2 и т.д.

3. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ

3.1. Сущность метода заключается во взаимодействии антигена с антителами в
лунках полистиролового планшета и последующим выявлением полученного
комплекса иммунопероксидазным конъюгатом на основе антител, вызывающим
разложение субстрат-индикаторного раствора и окрашивание содержимого лунок
планшета в случае положительной реакции.

3.2. Для исследования в лабораторию направляют от больных животных пробы
фекалий от собак, кошек, норок и слизистые трубки от норок (взятые в первые
дни болезни), от трупов - участки толстого отделов кишечника, сердечные
мышцы взятые от павших животных в первые часы после гибели. Из фекальных
масс и кусочков органов, подлежащих исследованию, готовят 10%-ную суспензию
на фосфатно-буферном растворе (ФБР) и после центрифугирования при 2000-
3000 об.мин вносят по 0,1 мл надосадка в лунки. Материал можно однократно
замораживать и хранить до исследования в морозильной камере бытового
холодильника. Если животные были вакцинированы против парвовироза,
исследования проводят не ранее, чем через 10 дней после вакцинации.

4. Подготовка компонентов набора и оборудования для проведения
исследований

4.1. Для проведения ИФА используют: одно-, шести- и восьмиканальные
автоматические пипетки со сменными наконечниками, термостат с температурой
нагрева 37,0+-0,5°С, бытовой холодильник, рН-метр (типа 121 и 340 или др.), для
автоматического учета результатов - спектрофотометр с вертикальным лучом.

4.2. Приготовление рабочих растворов реагентов

4.2.1 . 1 М раствор КББ, рН=9,4-9,6. Содержимое флакона № 5 растворяют в 12 мл
дистиллированной воды. Полученный раствор используют для растворения
сухого специфического моноклонального иммуноглобулина g (ампула/флакон №
1), которым "сенсибилизируют" полистироловые планшеты.

4.2.2. 1 М ФБР-Тени, рН=7,2-7,4. Содержимое флакона №6 растворяют в 600 мл
дистиллированной воды. В полученный раствор добавляют из флакона № 7
хлористый натрий (5,1 г) и из флакона n8 Твин-20 (0,6 мл).

4.2.3. Раствор ФБР-Твин-БСА. В отдельную емкость отбирают 100 мл раствора
ФБР-Твин (п. 2.2.2.) и добавляют к нему содержимое флакона №9 (1,0 г БСА).
Этот раствор используют для разведения положительного и отрицательного
контролей, конъюгата и исследуемых образцов.

4.2.4. Промывочный раствор ФБР-Твин рН 7,2-7,4. 500 мл раствора (п. 2.2.2.)
используют для промывания полистироловых планшетов.

4.2.5. Субстрат-индикатонный раствор с ТМБ находится в готовом виде и
должен быть прозрачным, светло-голубого оттенка.

5. Постановка реакции

5.1. "Сенсибилизация" лунок полистиролового планшета специфическим
иммуноглобулином.
Содержимое ампулы/флакона № 1 растворяют в 11 мл КББ рН 9,4-9,6 (п.
4.2.1) и несколько раз пилотируют, избегая образования пены. Полученного
объема достаточно для одного планшета. Во все лунки планшета вносят по 0,1
мл приготовленного раствора иммуноглобулина g и закрыв планшет крышкой,
оставляют на 3-4 ч при температуре З7С или на 18 часов при 4°С.

5.2. После инкубации лунки планшета освобождают от материала резким
встряхиванием, промывают и подсушивают. Промывание осуществляют
раствором ФБР-Твин (п. 4.2.2.) четыре раза. Каждая лунка заполняется доверху;
планшет с промывочным раствором оставляют на 3-5 мин., периодически
покачивая. Затем планшет подсушивают постукиванием по сложенной в
несколько слоев фильтровальной бумаге.
Если нет возможности использовать планшет полностью, заполнив ряды
исследуемыми образцами, проводят блокировку раствором ФБР-Твин-БСА (п.
4.2.3), внося по 0,1 мл раствора в лунку, и инкубируют 30 мин при 37°С. После
этого планшеты освобождают от материала резким встряхиванием и
подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной
бумаге. Планшет помещают в плотно закрывающийся сухой полиэтиленовый
пакет (пакет запаивают) и хранят до момента использования при температуре от
минус 20 до минус 40° С в условиях, не допускающих проникновения влаги. По
мере необходимости берут стрипы (пластинки с 8-ю лунками), промывают
раствором ФБР-Твин (п. 4.2.2) и используют в реакции.

5.3. В ампулу(флакон) n2 со специфическим лиофилизированным антигеном
(К+), вносят ФБР-Твин (п. 4.2.2) до рабочего разведения, указанного на этикетке
ампулы (флакона). Полученный раствор вносят по 0,1 мл в две лунки -
положительный контроль (К+) (см. схему 1).

5.4. Содержимое ампулы (флакона) № 3 - отрицательный контроль растворяют так
же, как и специфический положительный контроль (см п. 5.3) и полученный
раствор вносят по 0,1 мл в две лунки - отрицательный контроль (К').

5.5. На каждый исследуемый образец, положительный и отрицательный контроли,
используют по 2 лунки планшета, в которые вносят по 0,1 мл исследуемого
материала.
Две лунки в планшете оставляют для контроля пероксидазного конъюгата.
В эти лунки, вместо антигена, вносят по 0,1 мл ФБР-Твин-БСА. Таким образом,
для трех контролей необходимо предусмотреть 6 лунок (по 2 на каждый
контроль). Примерное расположение контролей представлено в схеме № 1 и 2.
Время инкубации планшета с нанесенными пробами 1 ч при 37С.
Материал из лунок удаляют, тщательно 4-х кратно промывают раствором ФБР-
Твин и планшет подсушивают.

5.6. Содержимое ампулы № 4 - пероксидазный конъюгат (Пх-кон.) растворяют в
0,1 мл буфера ФБР-Твин-БСА затем, после растворения, добавляют 0,9 мл
данного раствора. Несколько раз пипетируют, избегая образования пены. Объем
полученного раствора доводят до 10,0 мл буфером ФБР-Твин-БСА или буфером-
стабилизатором (флакон n13) и вносят по 0,1 мл во все лунки планшета.
Конъюгат, растворенный в буфере-стабилизаторе, можно хранить 2-3 месяца при
4°С и использовать по мере необходимости. Планшет закрывают крышкой и
инкубируют 1 ч при 37°С. Затем материал из лунок удаляют, тщательно 4-х кратно
промывают раствором ФБР-Твин и планшет подсушивают.

При необходимости, для исследования небольшого количества проб (от 1
до 6) поступают следующим образом: проводят работу по пп.4.1-5.2., а затем из
планшета вынимают один стрип, т.е. пластинку с восемью лунками и размещают
пробы так, как указано на схеме № 2.

5.7. Для приготовления раствора А содержимое флакона №11 (1 таблетка - 5 мг
ОФД) растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Для приготовления раствора
Б содержимое флакона № 10 (1 таблетка фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ) с
перекисью водорода) растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Растворы А и
Б непосредственно перед использованием объединяют во флаконе,
защищенном от прямого источника света. Приготовленный субстрат-
индикаторный раствор вносят в объеме 0,1 мл в лунки планшета и инкубируют
15-20 мин при комнатной температуре в темном месте. При использовании в
качестве субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, последний вносят в каждую
лунку по 0,1 мл и инкубируют в течение 15-20 мин в темном месте до
интенсивного окрашивания контрольных лунок.

5.8. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 0,1 мл 0,18 М
раствора серной кислоты (можно использовать 0,3 М фосфорную или 0,12 М
соляную кислоты) и учитывают по изменению окраски образовавшегося
реакционного продукта.

6. Учет результатов реакции

6.1. Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны, для
субстрат-индикаторного раствора ОФД при 492 нм, а для ТМБ при 650 нм до
остановки реакции и при 450 нм после остановки реакции кислотой, а при
отсутствии прибора - визуально (останавливать реакцию в данном случае не
рекомендуется).
Лунки с положительным контролем должны иметь сине-голубое
окрашивание для ТМБ (желтое после остановки реакции кислотой) и желто-
коричневое для ОФД. Оптическая плотность положительного контроля должна
быть не ниже 0,3 единиц.
Лунки с отрицательным контролем и контролем конъюгата должны
оставаться бесцветными или светло-голубыми (желтыми после остановки
реакции).
Лунки, в которых присутствует специфический антиген, имеют сине-голубое
(желтое после остановки реакции) специфическое окрашивание различной
интенсивности, в зависимости от концентрации антигена.

6.2. При спектрофотометрическом учете положительной считают реакцию, когда
отношение показателен оптической плотности в опытных лунках (Р) к
контрольному, отрицательному (n) составляет (Р/n) не менее 2,1.

6.3. При визуальном учете лунки с отрицательным контролем и лунки для
контроля конъюгата должны оставаться бесцветными. Лунки, в которых есть
специфический антиген, должны иметь желто-коричневое окрашивание
различной интенсивности при использовании ОФД и сине-зеленое (желтое после
остановки реакции) при использовании ТМБ в качестве субстрата.
Положительной считают реакцию, когда заметна четкая разница в интенсивности
окрашивания опытных и контрольных отрицательных лунок планшета.
Предложенный метод целесообразно использовать при комплексной диагностике
на парвовирусный энтерит собак, вирусный энтерит норок и панлейкопению
кошек.

7.ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

7.1. В случае отсутствия активности у отдельных компонентов набора рекламацию
на качество тест-системы для иммуноферментной диагностики возбудителя
парвовирусного энтерита собак, вирусного энтерита норок и панлейкопении кошек
в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии «О порядке
предъявления рекламации на ветеринарные препараты отечественного
производства и закупаемые по импорту» М5 22-7/28 от 8 мая 1992 г. направляют
на предприятие-изготовитель НПО НАРВАК (123098, Москва, ул. Гамалеи, 16) , во
Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля,
стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу:
123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5 и ЦНПВЛ (Москва, Косино, ул.
Оранжерейная, 23). При наличии невскрытых наборов с препаратами данной
серии один набор направляют в ВГНКИ.

Временное наставление разработано НПО НАРВАК, рассмотрено и одобрено
на заседании Совета по ветеринарным препаратам при Департаменте
ветеринарии Минсельхозпрода РФ 12.02.1998 г., протокол №1, nООО6ОЗ-ОП

Начальник отдела ветеринарно-санитарной экспертизы и лабораторной работы
В. И. Белоусов

Схема 1 . Схема 2.