НАСТАВЛЕНИЕ

МИНИСТЕРСТВО УТВЕРЖДАЮ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Зам.начальника
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии

ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ

n 13-7-2/1221 27 апреля 1998 г.

ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора для выявления
антигена вируса чумы плотоядных
иммуноферментным анализом
(ИФА)(для широкого производственного
испытания до 01.2000 г.)

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Набор предназначен для выявления специфического антигена вируса чумы
плотоядных в материале от больных и экспериментально зараженных
животных ИФА.

1.2. Набор рассчитан на проведение 45 анализов при скрининге, т. е. в двух
повторах, 11 проб при титровании исследуемого материала с разведения 1:2
до 1:256, а также может быть использован для работы с небольшим
количеством проб: 1, 2 и т .д.

1.3. Компоненты набора выпускают в закрытых флаконах (ампулах). На
ампулы (флаконы) с каждым компонентом наклеивают или несмываемой
краской по стеклу наносят этикетки с указанием: для специфических антигенов,
иммуноглобулинов, пероксидазных конъюгатов краткого названия компонента,
количества препарата в ампуле, номера серии, даты изготовления и рабочего
разведения препарата, а для неспецифических компонентов - краткого названия
компонента, количества препарата в ампуле (флаконе), номера серии и даты
изготовления.

1.4. На каждую коробку с диагностическим набором наклеивают этикетку, в
которой указывают: наименование и товарный знак предприятия-изготовителя,
полное название набора, перечень компонентов, входящих в набор, количество
ампул (флаконов), титр (рабочее разведение), номер серии набора, номер
контроля, дату изготовления набора, срок годности, условия хранения и
обозначения ТУ.

1.5. Диагностический набор транспортируют и хранят при температуре от 2 до
8С. Не допускается хранение при минусовой температуре.

1.6. Срок годности диагностического набора - 6 мес со дня изготовления.

2. СОСТАВ НАБОРА

2.1. Диагностический набор для выявления антигена вируса чумы плотоядных в
ИФА состоит из 13 компонентов.

Специфические компоненты (в виде сухой аморфной массы);

№1. Специфический моноклональный иммуноглобулин g (igg),
лиофилизированный (белый) -1 ампула/флакон, 0,1 мл (подложка).
Используется для сенсибилизации полистироловых планшетов.

№2. Специфический антиген вируса чумы плотоядных ВЧП
(аттенуированный вакцинный штамм), лиофилизированный (светло-желтый) -
1 ампула; 1,0 см3. Используется в качестве положительного контроля ( К+).

№ 3. Лизат клеток без вируса чумы плотоядных, лиофилизированный
(светло-желтый или розовый)- 1 ампула, 1,0 см3. Используется в качестве
отрицательного контроля ( К-).

№4. Специфический поликлональный/моноклональный
иммуноглобулин g, конъюгированный с пероксидазой хрена: пероксидазный
конъюгат (Пх-кон.) лиофилизированный (светло-желтый) - 1 ампула; 0,1 см3.
Используется для выявления комплекса антиген-антитело.

Неспецифические компоненты (в виде бесцветной жидкости):

№5. 1М раствор карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ) рН 9,4-9,6 - 1
флакон; 1,3 см3.

№6. 1М фосфатно-буферный раствор (ФБР), рН 7,2-7,4 - 1 флакон; 6,0
см3.

№7. Натрий хлористый - 1 флакон; 5,1 г.

№8. Твин-20 - 1 флакон; 0,6 см3

№9. Бычий сывороточный альбумин (БСА) (белый кристаллический
порошок) - 1 флакон; 1,0 г .

№10. Буфер-стабилизатор для разведения конъюгата - 1 флакон- 10,0 см3

№11. Тетраметилбензидин (ТМБ) - субстрат - 2 флакона по 5,0 см3.

№12. Плоскодонный полистироловый планшет 96-луночный - 1 штука.

Наставление по применению набора.

3. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ

3.1. Сущность метода заключается во взаимодействии антигена с антителом в
лунках полистиролового планшета и последующим выявлением полученного
комплекса иммунопероксидазным конъюгатом, вызывающим разложение
субстрат-индикаторного раствора и окрашивание содержимого лунок
планшета в случае положительной реакции.
3.2. Для исследования в лабораторию присылают носовые и конъюнктивальные
смывы от больных и подозреваемых в заражении животных с признаками
ринита и конъюнктивита, кровь, а также кусочки паренхиматозных органов
(селезенки, головного мозга, легких и др.), взятые от павших животных в
первые часы после гибели. Материал однократно замораживают и хранят в
морозильной камере бытового холодильника не более 1 мес. Из кусочков
паренхиматозных органов, подлежащих исследованию, готовят 10%-ную
суспензию на фосфатно-буферном растворе (ФБР) и после центрифугирования
при 2000-3000 об/мин вносят по 0,1 мл надосадка в две лунки. Носовые и
конъюнктивальные смывы исследуют с разведения 1:2 на ФБР-Твин-БСА.
Если животные были вакцинированы против чумы, исследования проводят
не ранее, чем через 10 дней после вакцинации.

4. ПОДГОТОВКА КОМПОНЕНТОВ НАБОРА И
ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1.Для проведения ИФА используют: одно- и восьмиканальные
автоматические пипетки со сменными наконечниками, термостат с
температурой нагрева (37,0 ± О,5)гр.С, бытовой холодильник, рН-метр, для
автоматического учета результатов - спектрофотометр с вертикальным лучом
и фильтрами (Л=450,650 нм).

4.2. Приготовление рабочих растворов реагентов

4.2.1. Приготовление 1М раствора КББ, рН=9,4-9,6. Содержимое флакона №5
растворяют в 11,0 см3 дистиллированной воды (в набор не входит).
Полученный раствор используют для растворения сухого специфического
моноклонального иммуноглобулина g (ампула №1), которым
"сенсибилизируют" полистироловые планшеты.

4.2.2. Приготовление 1М раствора ФБР-Твин рН=7,2-7,4. Содержимое
флакона №6 растворяют в 600 см3 дистиллированной воды. В полученный
раствор добавляют содержимое флакона №7 и флакона №8.

4.2.3. Приготовление раствора ФБР-Твин-БСА. В отдельную емкость отбирают
100 см3 раствора ФБР-Твин ( п.4.2.2.) и добавляют к нему содержимое
флакона №9 (1,0 г БСА). Этот раствор используют для разведения
положительного и отрицательного контролей, конъюгата и исследуемых
образцов.

(Приготовленный раствор ФБР-Твин-БСА расфасовывают во флаконы по 5 см3
и замораживают в морозильной камере бытового холодильника. В дальнейшем
используют по мере надобности).

4.2.4. Промывочный раствор ФБР-Твин рН 7,2-7,4. 500 см3 раствора
( п.4.2.2.) используют для отмывки полистироловых планшетов (хранить в
холодильнике при 4С).

4.2.5. Субстрат-индикаторный раствор с ТМБ находится в готовом виде и
должен быть прозрачным, светло-голубого оттенка.

5.ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ

5.1. "Сенсибилизацию" лунок полистиролового планшета специфическим
иммуноглобулином проводят следующим образом.

Содержимое ампулы №1 растворяют в 11 см3 КББ рН 9,4-9,6 (п.4.2.1)
и несколько раз пипетируют, избегая образования пены. Полученного объема
достаточно для одного планшета. Во все лунки планшета вносят по 0,1 см3
приготовленного раствора иммуноглобулина g и закрыв планшет крышкой,
оставляют на 3-4 ч при температуре 37гр.С или на 18 ч при 4гр.С.

5.2. После инкубации лунки планшета освобождают от материала резким
встряхиванием, промывают и подсушивают. Промывание осуществляют
раствором ФБР-Твин (п.4.2.2.) четыре раза. Каждая лунка заполняется
доверху, планшет с промывочным раствором оставляют на 3-5 мин,
периодически покачивая. Затем планшет подсушивают постукиванием по
сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
Если нет возможности использовать планшет полностью, заполнив ряды
образцами, проводят блокировку раствором ФБР-Твин-БСА (по п.4.2.3), внося
по 0,1 см3 раствора в лунку и инкубируют 30 мин при 37 гр.С. После чего
планшеты освобождают от материала встряхиванием и подсушивают
постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
Планшет помещают в плотно закрывающийся сухой полиэтиленовый пакет,
пакет запаивают и хранят до момента использования при температуре от минус
20 до минус 40С в условиях, не допускающих проникновения влаги. По мере
необходимости берут стрипы (пластинки с 8-ю лунками), промывают
раствором ФБР-Твин (п.4.2.2) и используют в реакции.

5.3. В ампулу №2 со специфическим лиофилизированным антигеном (К+)
вносят 2,5 см3 ФБР - Твин (п.4.2.2.). Полученный раствор вносят по 0,1 см3 в
две лунки -положительный контроль (К+) (см. схему 1), а оставшийся
материал расфасовывают по 0,2 см3 в пластиковые пробирки, замораживают
при минус 20гр.С и используют по мере необходимости.

5.4. Содержимое ампулы №3 (отрицательный контроль К-) растворяют так же
как и специфический положительный контроль (см. п. 5.3.) и полученный
раствор вносят по 0,1 см3 в две лунки.

5.5. На каждый исследуемый образец, положительный и отрицательный
контроли, используют по 2 лунки планшета, в которые вносят по 0,1 см3
исследуемого материала. Две лунки в планшете оставляют для контроля
пероксидазного конъюгата. В эти лунки вместо антигена вносят по 0,1 см3
ФБР-Твин-БСА. Таким образом, для трех контролей необходимо
предусмотреть 6 лунок (по 2 на каждый контроль). Примерное расположение
контролей указано в схеме №1. Время инкубации планшета с нанесенными
пробами 1 ч при 37гр.С. Материал из лунок удаляют, тщательно 4-х кратно
промывают раствором ФБР-Твин и планшет подсушивают.

5.6. Содержимое ампулы №4 - пероксидазный конъюгат (Рх-КОН) растворяют
в 1,0 см3 буфера-стабилизатора. Несколько раз пипетируют, избегая
образования пены. Объем полученного раствора доводят до 10,0 см3 (ФБР-
Твин-БСА) и вносят по 0,1 см3 во все лунки планшета. Закрывают крышкой
и инкубируют 1 ч при 37гр.С, после чего содержимое удаляют, лунки промывают
ФБР-Твин 4 раза и планшет подсушивают.

5.7. Во все лунки планшета вносят по 0,1 см3 субстрат-индикаторного
раствора ТМБ (компонент №11). Планшет инкубируют 15-20 мин при
температуре 20-25гр.c в темном месте.

5.8. Реакцию для спектрофотометрического учета рекомендуется
останавливать добавлением в каждую лунку по 0,05 см3 1Н раствора серной
кислоты (в комплект не входит).

5.9. Для исследования небольшого количества проб - 1,2 и т.д. проводят
«сенсибилизацию» планшета по п.4.1-4.2, затем из планшета вынимают один
стрип и размещают пробы так, как указано на схеме №2. При этом конъюгат,
ампула №4, растворяют не в ФБР-Твин-БСА, а в 1 см3 буфера-стабилизатора, а
оставшуюся часть хранят в холодильнике при 4 гр.С, используют его по мере
необходимости. На 1 стрип готовят следующее разведение: 0,01 см3 конъюгата
+1 см3 ФБР-Твин-БСА. Растворенный в стабилизаторе конъюгат может
храниться при 4С 2-3 мес. После добавления конъюгата и инкубации в
течение 1 ч при 37С выполняют то же, что в п. 5.7. и т.д.

6. УЧЕТ И ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ

6.1. Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 650
нм до остановки реакции серной кислотой или при длине волны 450 нм после
остановки реакции, а при отсутствии прибора - визуально (останавливать
реакцию в данном случае не рекомендуется).

Лунки с положительным контролем должны иметь сине-голубое
окрашивание (желтое - после остановки реакции). Оптическая плотность
положительного контроля должна быть не ниже 0,3 единиц.

Лунки с отрицательным контролем и контролем конъюгата должны
оставаться бесцветными или светло-голубыми ( желтыми после остановки
реакции).

Лунки, в которых присутствует специфический антиген, имеют сине-
голубое (желтое после остановки реакции) специфическое окрашивание
различной интенсивности в зависимости от концентрации антигена.

6.2. При спектрофотометрическом учете положительной считают реакцию,
когда отношение показателей оптической плотности (Р/n) в опытных лунках
(Р) к контрольному, отрицательному (n) составляет не менее 2.1.

6.3. При визуальном учете положительной считают реакцию, когда заметна
четкая разница в интенсивности окрашивания опытных и контрольных
отрицательных лунок планшета.

Предлагаемый метод целесообразно использовать при комплексной
диагностике на чуму плотоядных.

7. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

7.1. b случае отсутствия активности у отдельных компонентов набора
рекламацию на качество набора направляют в адрес предприятия-
изготовителя (НПО НАРВАК, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16),
Всероссийского государственного научно-исследовательского института
контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов
(ВГНКИ) 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5 и ЦНПВЛ (Москва,
Косино, Оранжерейная ул., 23) в соответствии с указанием Главного
управления ветеринарии "О порядке предъявления рекламаций на
ветеринарные препараты отечественного производства и закупаемые по
импорту" №22-7/28 от 8 мая 1992 года. При наличии невскрытых наборов с
препаратами данной серии один набор направляют в ВГНКИ.

Временное наставление подготовлено НПО НАРВАК, рассмотрено и
одобрено на Совете по ветеринарным препаратам при Департаменте
ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 12.02.1998 г., протокол № 1, № 000602-ОП.

Начальник отдела ветеринарно-санитарной экспертизы и лабораторий
В.И.Белоусов

Схема 1 .

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
А
b k+
c k+
d k-
e k-
f ПхК
g ПхК
h

Схема 2
a k-
b k-
c k+
d k+
e пр.1
f пр.1
g пр.2
h пр.2