МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Зам.начальника Департамента ветеринарии ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ n 13-7-2/1206 03 апреля 1998 г. ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ по применению набора для определения антител к mycoplasma, gallisepticum иммуноферментным методом (в порядке широкого производственного испытания в 1998-1999гг.) 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Набор предназначен для определения специфических антител против m.gallisepticum в сыворотках крови кур иммуноферментным методом (ИФА). Сущность метода заключается в выявлении комплекса антиген- антитело на поверхности лунок полистиролового планшета. Образовавшийся специфический комплекс взаимодействует с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом против lgg кур. Реакцию проявляют, добавляя субстратную смесь, которая вызывает окрашивание содержимого лунок планшета. 1.2. Для исследования в лабораторию доставляют из птицехозяйств сыворотки крови кур по 0,2-0,3 см3. Пробы сывороток хранят в морозильной камере бытового холодильника. Набор рассчитан на проведение 176 анализов сывороток крови кур при исследовании в одном разведении 1:400, при раститровке сывороток от 1:100 до 1:12800 - на 20 анализов. 1.3. Набор состоит из иммуноспецифических и неспецифических компонентов (К1-К8). К иммуноспецифическим компонентам относятся: К1- положительная сыворотка крови кур к m. gallisepticum (положительный контроль) цельная лиофилизированная, сухая мелкопористая масса белого или светло-желтого цвета 1,О см3 - 2 ампулы (флакона); К2 - отрицательная сыворотка крови кур (отрицательный контроль), не содержащая антител к М. gallisepticum, цельная, лиофилизированная, сухая мелкопористая масса белого или светло-желтого цвета, 1 см3 2 ампулы (флакона); КЗ - очищенный антиген m. gallisepticum адсорбированный в лунках планшета для ИФА - 2 планшета; К4 - антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против lgg кур, лиофилизированный, сухая мелкопористая масса белого цвета, 1.0 см3 - 2 ампулы (флакона). Рабочее разведение указывается для каждой серии. К неспецифическим компонентам относятся: К5 - буферный р-р n 1 для разведения испытуемых и контрольных проб антивидового конъюгата прозрачная бесцветная жидкость, 2,0 см3 - 2 флакона; К6 - субстратный буферный р-р прозрачная бесцветная жидкость-, 1,О см3 - 2 флакона; К7 - субстрат - ортофенилендиамин (ОФД), таблетка сероватого цвета, 6 мг, 2 шт. - 2 флакона; К8 - гидроперит таблетка белого цвета, 0,5 г, 2 шт. - 2 флакона. Положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, конъюгат антивидовой иммунопероксидазный, буферный раствор для разведения образцов и конъюгата, таблетки ОФД и гидроперита должны быть расфасованы во флаконы стеклянный, пенициллиновые для розлива биопрепаратов вместимостью 10 см3 укупорены пробками резиновыми для пенициллиновых флаконов с лекарственными препаратами, обкатаны колпачками и прокладками алюминиевыми к флаконам для лекарственных средств. На каждый флакон или ампулу должна быть наклеена этикетка из бумаги этикеточной с указанием: - названия набора; - названия компонента; - номера серии; - срока годности; - рабочего разведения. 1.4. Флаконы (ампулы) укладываются в коробки картонные. На каждой коробке должна быть наклеена этикетка из бумаги этикеточной с указаннем: - наименования предприятия - изготовителя; - названия набора; - номера контроля; - номера серии; - номера ТУ; - срока годности; - условий хранения; - наименования компонента. 1.5. Ампулы, флаконы без этикеток, с трещинами, с изменной консистенцией подлежат выбраковке, обеззараживанию и утилизации. 1.6. Срок годности набора 6 мес. со дня его комплектации при хранении в защищенном от света месте при температуре 2-8 гр.С. 2. Порядок применения набора. 2.1. Подготовка компонентов набора и оборудования для проведения исследований 2.1.1. Для постановки метода ИФА используют: одно- и восьмиканальные автоматические пипетки со сменными наконечниками, бытовой холодильник, рН-метр (тип 121 или 340), спектрофотометр с вертикальным лучом (длина волны 492 нм). 2.1.2. Перед приготовлением рабочих растворов набор с компонентами выдерживают 30 мин при температуре 18-20 гр.С. 2.1.3. Раствор №1. Содержимое флакона К5 растворяют в 50 см3 дистиллированной воды. Данный раствор используют для разведения контрольных сывороток, испытуемых проб, антивидового конъюгата. Раствор №1 хранят не более 7 суток при температуре 2-8 гр.С. 2.1.4. Раствор №2. Субстратный буферный раствор ph 4,9-5,0. Для приготовления субстратного буферного раствора содержимое флакона К6 растворяют в 10 см3 дистиллированной воды. Полученный раствор должен иметь рН 4,9-5,0. 2.1.5. Раствор №3. Содержимое флакона К1 растворяют в 1,0 см3 раствора №1. Готовят перед использованием. Допускается хранение в течение 3 сут при температуре 2-8°С. 2.1.6. Раствор №4. Содержимое флакона К2 с отрицательной сывороткой крови кур растворяют в 1,0 см3 раствора №1. Растзор №4 готовят перед использованием, допускается хранение в течение 3 суток при температуре 2-8 С. 2.1.7. Раствор №5. Содержимое флакона К4 с антивидовым конъюгатом растворяют в 1,0 смЗ раствора №1. Для получения рабочего разведения из этого флакона отбирают 0,5 см3 на 10,0 см3 раствора №1 (на 1 планшет). Раствор №5 готовят перед использованием. Раствор хранится в течение 3 сут при температуре 2-8° С. 2.1.8. Раствор №6. Субстратно-индикаторная смесь. Содержимое- флакона К7 (ОФД) растворяют в 10,0 смЗ раствора №2. После полного растворения ОФД добавляют 1 таблетку гидроперита (К8). Готовят раствор №6 непосредственно перед использованием. Раствор №6 хранению на подлежит. 2.2. Постановка реакции 2.2.1. Из комплекта набора берут планшет (КЗ), в лунках которого адсорбирован очищенный антиген М. gallisepticum, и используют для постановки иммуноферментного метода. 2.2.2. Разведение сывороток. Образцы исследуемых проб сывороток крови разводят 1:100 раствором №1. С этой целью к 0,01 см3 сыворотки крови кур добавляют 1,0 см3 раствора n1 и перемешивают. 2.2.3. В лунки рядов планшета В1-12... Н1-12 вносят по 0,1 см3 раствора №1, а в лунки А2-11 вносят по 0,2 см3 исследуемых проб сывороток крови, приготовленных по п.3.2, и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с 1:100 до 1:12800. В лунки А1 и А12 вносят разведения 1:100 контрольных (отрицательной п. 2.1.6 и положительной п. 2.1.5) сывороток и также проводят раститровку по вертикальным рядам. Из последних лунок Н1-Н12 удаляют по 0,1 см3. 2.2.4. При обнаружении высоких титров антител в испытуемых пробах проводят раститровку по горизонтальным рядам планшета. 2.2.5. Планшет осторожно встряхивают, закрывают крышкой и инкубируют при температуре 18-20°С в течение 1 ч. Затем лунки планшета освобождают от содержимого путем встряхивания и трехкратно промывают дистиллированной водой. 2.2.6. Готовят раствор №5 по п. 2.1.7. и вносят во все лунки планшета по 0,1 см3, затем опять инкубируют при температуре 18-20 С в течение 1 ч. и промывают как в п. 2.2.5. 2.2.7. Готовят раствор №6 по п. 2.1.8. и вносят во все лунки по 0,1 см3. Оставляют при температуре 18-20° С в темном месте в течение 15-20 мин. Останавливают реакцию добавлением в каждую лунку 0,05 см3 серной кислоты, приготовленной путем растворения 3 см3 концентрированной серной кислоты (ГОСТ 4204-77,хч) в 10,0 см3 дистиллированной воды. 2.2.8. Выявление специфических антител в сыворотках можно проводить и без раститровки испытуемых сывороток. В этом случае во все лунки планшета А2-12... Н2-12 вносят по 0,1 см3 исследуемых проб сывороток в разведении 1:400, используя по 1 лунке на каждую пробу. В три лунки вертикального ряда А1, В1, С1 вносят положительные, в три следующие Д1, Е1, f1 - отрицательные контрольные сыворотки в разведении 1:100, а лунки g1, Н1 служат контролем конъюгата и заполняются по 0,1 см3 раствора №1. Остальные этапы проводят по п. 2.2.5, 2.2.6, 2.2.7. 2.3. Учет результатов реакции 2.3.1. Учет результатов анализа проводят после остановки реакции одним из способов: визуально - по интенсивности окрашивания содержимого лунок планшета или инструментально с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом при длине волны 492 нм. 2.3.2. При визуальном способе учета первоначально проводят оценку результатов по контрольным лункам планшета: положительный контроль при раститровке окрашивается в желтый цвет различной интенсивности. В лунках с отрицательным контролем раствор остается неокрашенным или незначительно желтеет. При визуальном учете сравнивают окраску содержимого лунок планшета испытуемых проб с окраской лунок контрольных образцов. За титр испытуемой сыворотки принимают последнее разведение ее, при котором наблюдают видимое глазом цветовое окрашивание, более интенсивное по сравнению с отрицательным контролем. Положительными считают пробы, начиная с разведения 1:400 и выше. 2.3.3. Инструментальный фотометрический учет результатов анализа позволяет количественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерения значении оптической плотности (ОП 492 нм), конечным разведением испытуемое сыворотки считается последнее ее разведение, а котором оптическая плотность превышает таковую отрицательного контроля в 2,0-2,1 раза. Оптическая плотность отрицательного контроля не должна превышать 0,1-0,15 о.е. 2.4. Расчет титра сывороток при постановке реакции в одном разведении 1:400 Выявление специфических антител в сыворотках крови можно проводить и без раститровки испытуемых сывороток. В этом случае во все лунки планшета от А2-12 до Н2-12 вносят по 0,1см3 исследуемых проб сывороток в разведении 1:400 в двух повторностях, используя по 2 лунки на каждую пробу. В две лунки В1, С1 вносят положительные, а в две последующие Д1, Е1 - отрицательные контрольные сыворотки в разведении 1:400. Лунки f1, g1, Н1 служат контролем коньюгата и заполняются по 0,1 см3 раствором n5. Учет результатов реакции проводится спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Для предполагаемого варианта учета различия между средними значениями положительной и отрицательной контрольных сывороток (РСх - nСх) должно быть более 0,5. Значения оптической плотности для отрицательного контроля далжны быть менее или равны 0,150. Наличие или отсутствие антител к М. gallisepticum в исследуемых пробах определяют путем вычисления отношения средней оптической плотности (ОП) испытуемой сыворотки (s) при длине волны 492 нм к среднему значению ОП положительного контроля (Р) (s/Р). Положительная контрольная сыворотка стандартизована и имеет определенный титр антител к М. gallisepticum. Если s/Р-отношение меньше или равно 0,15, сыворотка будет считаться отрицательной. Если s/Р- отношение больше чем 0,15, сыворотка содержит антитела М. gallisepticum. Конечное значение титра может быть подсчитано по s/Р-отношению при разведении 1 :400. Расчет титра: 1. Расчет среднего значения ОП отрицательного контроля (ncх): Значение В1 ОП(492)+Значение С1 ОП(492) -----------------------------------------=ncx 2 Пример, 0,100+0,120 ------------=О,110 (nСх=0,110) 2 2. Расчет среднего значения ОП положительного контроля (РСх): Значение Д1 ОП(492)+Значение Е1 ОП(492) -----------------------------------------=pcx 2 Пример, 0,720+0,690 -----------=0,755 (РСх=0,755) . 2 3. Расчет s/Р- отношения: ОП(492) испытуемом сыворотки-nСх --------------------------------=s/p РСх-nСх Пример: Значение образца=0,480 0,480 -0,110 0,370 ------------=-----=0,574 (Значение s/p=0,574) 0,755-О,110 0,645 3. Порядок предъявления рекламаций В случае выявления неактивности компонентов набора или неспецифичности реакции, применение данной серии набора прекращают и, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Минсельхоза России от 8 мая 1992 года №22-7/28 "0 порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту", сообщают об этом предприятию-изготовителю и Всероссийскому государственному научно-исследовательскому институту контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и ЦНПВЛ. При наличии невскрытых наборов с препаратами данной серии один набор направляют с нарочным в ВГНКИ (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5). Временное наставление разработано НПФ "ЛИТЕК" при НИИ ФХМ РФ Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 24.04.97 г. (протокол №2 от 24 апреля 1997 г.) № 000556-ОП.