МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Зам.начальника
Департамента ветеринарии
ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ
n 13-7-2/1157 28 января 1998 г.
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора для диагностики
парвовирусного энтерита собак, норок и
панлейкопении кошек в реакции
торможения гемагглютинации (РТГА)
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Набор для диагностики парвовирусного энтерита собак, норок и панлейкопении кошек в
реакции торможения гемагглютинации предназначен для обнаружения возбудителей
болезни в кале и содержимом кишечника, а также специфических антител в сыворотках
крови животных.
1.2. Парвовирусы плотоядных агглютинируют эритроциты свиней. Это свойство используют
при выявлении антигена в реакции гемагглютинации (РГА) в кале и содержимом
кишечника. Полученные результаты должны быть подтверждены постановкой РТГА с
использованием специфической сыворотки.
1.3. Для диагностики парвовирусной инфекции в ветеринарную лабораторию направляют от
больных животных пробы кала массой 0,5-1,0 г, отобранные на ранних стадиях
проявления диареи, от трупов - толстый отдел кишечника с содержимым. Для
исследования иммунного статуса животных в лабораторию посылают сыворотку крови
(не менее 1 см3). Пробы не консервируют. При невозможности быстрого (в течение суток)
проведения исследования патматериала его замораживают и хранят при температуре
минус 10 гр.С не более одного месяца.
1.4. Набор рассчитан на выявление антигена при исследовании 20 проб материала и 20 проб
сыворотки крови. Набор состоит из следующих компонентов:
· раствора фосфатного буфера (ФБР) рН 6,6 - 4 флакона по 20,0 см3,
· суспензии формалинизированных эритроцитов 0,5%-ной концентрации - 4 флакона по
20,0 см3,
· сыворотки специфической против парвовирусных инфекций плотоядных с активностью в
РТГА не ниже 1:128 - 2 ампулы по 1 см3,
· сыворотки отрицательной (контрольной, неактивной в РТГА) - 2 ампулы по 1 см3,
· антигена специфического с активностью в РТГА не ниже 1:128 - 2 ампулы по 1 см3,
· 96-ти луночных плашек с u-образным дном - 2 штуки.
1.5. Препараты, входящие в набор, представляют собой:
· раствор фосфатного буфера - прозрачную бесцветную жидкость,
· сыворотки - (специфическая и контрольная) и антиген - сухую однородную
мелкопористую массу светло-желтого цвета,
· суспензия формалинизированных эритроцитов - темно-коричневую взвесь или осадок
эритроцитов в прозрачном растворе, при встряхивании разбивающийся во взвесь.
1.6. На флаконах (ампулах) с препаратами наклеены этикетки с обозначениями: краткого
названия препарата (антиген, сыворотка специфическая, сыворотка отрицательная,
суспензия эритроцитов, буферный раствор), активности в РТГА специфической сыворотки
и в РГА - антигена, номера серии и номера контроля, объема препарата в см3, даты
изготовления.
1.7. На каждой коробке с набором обозначены: наименование и товарный знак предприятия-
изготовителя, полное название набора и каждого из его компонентов, номера серии и
контроля, дата изготовления и срок годности (месяц, год), количество ампул и флаконов,
объем каждого препарата, условия хранения, ТУ.
1.8. Срок годности набора определяется длительностью хранения суспензии эритроцитов и
составляет 6 месяцев со дня ее изготовления при условии хранения в сухом, темном месте
при температуре +2...+8 гр.С. После вскрытия ампулированных препаратов их можно
хранить в замороженном состоянии не более месяца.
1.9. Ампулы и флаконы без этикеток, с нарушенной целостностью или укупоркой,
содержащие препарат с внешним видом, не соответствующим указанному в п. 1.5., а
также при наличии нерастворимых (неразбивающихся) хлопьев, осадка к использованию
не допускаются и уничтожаются. Утилизация ампул с антигеном производится
кипячением в течение 20 минут, утилизация остальных препаратов не требует
специальных мер безопасности.
2. ПОДГОТОВКА КОМПОНЕНТОВ
2.1. Перед постановкой РГА и РТГА лиофилизированные положительную и отрицательную
сыворотки и антиген растворяют в 1 см3 фосфатного буфера (ФБР). Растворенные
препараты годны для использования в течение недели при условии хранения их при
температуре +2...+4 С и в течение месяца в случае хранения их в замороженном
состоянии. Суспензию эритроцитов используют без разведения.
2.2. Подготовка материала к исследованию в РГА.
Для проведения диагностических исследований пробы кала или содержимого кишечника
массой 0,5-1,0 г помещают в пенициллиновые флаконы, разводят 1:10 физраствором натрия
хлорида или ФБР, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 15 мин.
Надосадочную жидкость сливают, добавляют к ней 2-5 капель хлороформа, тщательно
встряхивают и повторно центрифугируют. Верхний слой жидкости исследуют в РТГА.
2.3. Подготовка сывороток к исследованию в РТГА.
Для опеделения уровня специфических гуморальных антител испытуемую сыворотку крови
животного предварительно обрабатывают для удаления неспецифических ингибиторов
агглютинации следующим образом: прогревают в течение 30 мин, в водяной бане при
температуре 56±0,5 гр.С, затем добавляют к 0,5 см3 охлажденной сыворотки 2 капли (0,1 см3)
осадка эритроцитов свиньи и выдерживают при температуре +2...+4 гр.С два часа, после чего
проводят осаждение эритроцитов центрифугированием со скоростью 1500 об/мин, в течение 10
мин.
Специфическая и отрицательная сыворотки, входящие в набор, не нуждаются в
предварительной обработке.
2.4. Приготовление стандартного разведения антигена.
Испытуемый и специфический антигены при постановке РТГА должны содержать в 0,025
см3 4 гемагглютинирующих единицы (ГАЕ). Поэтому для приготовления рабочего разведения
исследуемого или стандартного антигена его разводят буферным раствором во столько раз,
сколько получают от деления гемагглютинирующего титра этого антигена на 4. Например,
ресуспендированный в 1 см3 ФБР антиген с титром 1:128 в РГА для использования в РТГА
нужно развести в 32 раза (128:4=32).
3. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
3.1. Постановка РГА.
Реакцию ставят микрометодом на 96-луночных пластиковых панелях с u-образным дном с
использованием ФБР и 0,5% суспензии эритроцитов. В два ряда (24 лунки) пластиковой
панели разливают по 0,05 см3 ФБР, в первую лунку вносят такое же количество исследуемого
материала и проводят серию двукратных разведений. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05
см3 0,5% суспензии эритроцитов, выдерживают пластины 1 час при температуре +2..+4 С,
после чего производят учет результатов.
3.1.1. Учет результатов РГА.
При агглютинации эритроцитов происходит склеивание их и равномерное распределение по
дну лунки в виде "зонтика".
Положительной считают такую реакцию, при которой в начальных лунках ряда наблюдается
равномерное распределение эритроцитов по дну и стенкам лунки в виде "зонтика"
(агглютинации), а в последующих - оседание на дно в виде "пуговки" или четко
контурированного кольца. При положительном результате в РГА проводят идентификацию
гемагглютинирующего агента в РТГА.
Титр гемагглютинации агента определяет величина максимального его разведения при
котором регистрируется агглютинация.
3.2. Постановка РТГА.
3.2.1.РТГА можно ставить в двух вариантах: для идентификации выделенного
гемагглютинирующего агента и для выявления наличия в сыворотках крови антител к
парвовирусу. В первом случае патматериал, иследование которого в РГА дало
положительный результат, исследуют со специфической сывороткой, во втором -
испытуемую сыворотку - со специфическим антигеном.
3.2.2. Методика постановки РТГА.
Для постановки РТГА в лунки пластин разливают по 0,025 см3 ФБР, затем в первую лунку
вносят по 0,025 см3 сыворотки и готовят ее двукратные разведения с 1:2 до 1:4096. В каждую
лунку добавляют по 0,025 см3 рабочего разведения антигена (4 ГАЕ) и выдерживают 1 час при
температуре +2...+4 гр.С. После этого в каждую лунку добавляют 0,05 см3 суспензии эритроцитов
свиньи. Планшет осторожно встряхивают и выдерживают при температуре +4 гр.С. Учет
реакции проводят через 1,5 часа.
3.2.3. Учет результатов РТГА.
При постановке РТГА положительной считают такую реакцию, при которой в начальных
лунках отмечают оседание эритроцитов на дно в виде "пуговицы" или четко контурированного
кольца, а в последующих - распределение их по дну лунки в виде "зонтика". Отрицательный
результат РТГА - во всех лунках ряда агглютинация эритроцитов (оседание в виде "зонтика").
Титр торможения гемагглютинации агента определяет величина максимального разведения
сыворотки, при котором еще регистрируется торможение агглютинации.
3.3. Постановка контрольных реакций.
Одновременно с постановкой РГА ставят контроли:
· эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации,
· активности стандартного антигена.
Одновременно с постановкой РТГА ставят контроли:
· эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации,
· активности специфической сыворотки,
· рабочей дозы стандартного и испытуемого антигенов.
3.3.1. Контроль эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации.
В 5 лунок планшета вносят по 0,05 см3 ФБР и суспензии эритроцитов. Пластину
выдерживают при температере +4 С. Учет реакции производят через 1-1,5 часа. Эритроциты
должны оседать на дно лунки в виде "пуговки" или четко контурированного кольца.
3.3.2. Активность стандартного антигена определяют в РГА как описано в п. 3.1., но
производят серию двукратных разведений антигена в одном ряду планшета (12 лунках).
Стандартный антиген должен агглютинировать эритроциты в титре, обозначенном на
этикетке, и быть не ниже 1:128.
3.3.3. Для проведения контроля рабочей дозы испытуемого и стандартного антигена в 5
лунках ряда готовят двукратные разведения в ФБР в объемах 0,025 см3, а затем вносят в
каждую лунку дополнительно по 0,025 см3 ФБР, после чего во все лунки добавляют 0,05
см3 суспензии эритроцитов. Планшет выдерживают при температуре +4 С. Учет реакции
проводят через 1,5 часа. Активность рабочей дозы испытуемого и контрольного
антигенов должна быть 4 ГАЕ (агглютинация в 2 лунках ряда).
3.3.4. Активность специфической сыворотки определяют в РТГА со стандартным антигеном
как описано в п. 3.2.2. Специфическая сыворотка должна тормозить
гемагглютинирующую активность антигена в титре, обозначенном на этикетке, и быть не
ниже, чем 1 : 128 .
3.4.Оценка результатов.
Диагноз на заболевание считают установленным в случае положительного результата РТГА
при исследовании фекалий или содержимого кишечника животного.
Наличие антител в сыворотке крови животного не может служить основанием для
постановки диагноза. Клинически здоровых животных с титрами гуморальных антител ниже
1:64 рекомендуется вакцинировать против парвовирусной инфекции.
4. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
4.1. В случаях выявления слабой активности или неспецифичности препаратов, входящих в
набор, их применение прекращают и сообщают об этом в ВГНКИ ветпрепаратов (123022,
Москва, Звенигородское ш., д.5), ЦНПВЛ (111162, Москва, ул. Оранжерейная, 23) и
организацию-изготовитель в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии
Минсельхоза РФ № 22-7/28 от 8.05.92 г. "О порядке предъявления рекламаций на
ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту". При наличии
невскрытых наборов данной серии один набор упаковывают, опечатывают и отправляют
в ВГНКИ.
Наставление рассмотрено и одобрено на Ветфармбиосовете (протокол № 3 от 21 мая 1996
г.). ПВР 1.03.0166-96