Наставление
                 сывороток кампилобактериозных
                моноспецифических агглютинирующих







ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ПОДГОТОВКА КУЛЬТУР ДЛЛ ИДЕНТИФИКАЦИИ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ КУЛЬТУР

ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

















    МИНИСТЕРСТВО
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ  ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                          УТВЕРЖДАЮ
                                           Заместитель руководителя
09.07.99г.   № 13-7-2/1689                 Департамента ветеринарии
                                               В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
сывороток кампилобактериозных
моноспецифических агглютинирующих

1.ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ.

1.1.Свыворотки кампилобактериозные моноспецифические агглютинирующие     
против Саmpylobacter fetus subspecies fetus, Саmpylobacter fetus subspecies 
venerealis, Саmpylobacter jejuni subspecies jejuni, , Саmpylobacter sputorum 
subspecies bubulus применяют для;

- идентификации культур кампилобактерий,
- контроля активности и специфичности антигена для реакции агглюти-
нации с вагинальной слизью (РАВc).

1.2.Сыворотки представляют собой прозрачную слегка опалесцирующую
жидкость бледно-желтого цвета без или с незначительным осадком белого цве-
та, легко разбивающимся при встряхивании.

1.3. Сыворотки в объеме по 1,0 - 2,0 куб.см выпускают в ампулах или флако-
нах, на которых несмываемой краской должна быть нанесена надпись или на-
клеена этикетка с указанием наименования предприятия-изготовителя, сокра-
щенного наименования сыворотки, ее количества, титра, номера серии, даты
изготовления, срока годности и обозначения стандарта.

Допускается другая фасовка сывороток, согласованная в установленном
порядке.

Ампулы (флаконы) с сыворотками упаковывают в картонные коробки с
разделительными перегородками.

      В каждую коробку с ампулами (флаконами) вкладывают наставление по
применению сывороток.

1.4. Срок годности сывороток три года со дня изготовления при условии
хранения в сухом темном месте при температуре от 2 до 8 гр.С.

1.5. Сыворотки в ампулах (флаконах) с трещинами, во флаконах с нару-
шенной укупоркой, содержащие посторонние примеси, плесень и с истекшим
сроком годности подлежат выбраковке.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ПОДГОТОВКА КУЛЬТУР ДЛЛ ИДЕНТИФИКАЦИИ.

2.1. Для выделения культур кампилобактерий используют полужидкие или
плотные питательные среды: мясо-печеночный пептонный полужидкий агар
(МПППЖА) с содержанием 0,15-0,2% агара и мясо-печеночный пептонный агар
(МППА) с содержанием 2-3% агара, в которые добавляют 5-10% дефибриниро-
ванной лизированной крови барана, лошади или 5-10% аминопептида крови.
Кроме МППА можно использовать эритрит-агар Дагестанского НИИ по произ-
водству питательных сред, "Капилобакагар" НПФ "Диавак" и НПО
"Питательные среды" ГНЦПМ г. Оболенск и другие среды.

2.2. Селектирующие свойства средам обеспечивает смесь антибиотиков,
которые не ингибируют рост кампилобактерий: полимиксин - 2 мг, рифампицин
      - 10,0 мг; амфотерицин - 2,0 мг; фузидин - 2,0 мг; ристомицин - 10,0 мг.

Рифампицин растворяют в 0,1 куб.см диметилсульфоксида или 96%-ного
спирта, а затем вместе с остальными антибиотики в 3,0 куб.см стерильной 
дистиллированной воды и вносят в 1000,0 куб.см среды, расплавленной и 
охлажденной до температуры 50-55 гр.С.

2.3. Посевы выращивают при температуре 37-38 гр.С в микроаэрофильных
условиях: 10% углекислого газа, 5% кислорода и 85% азота, в течение 6-10      
суток с ежедневным учетом результатов.

Создание атмосферы для культивирования кампилобактерий осуществля-
ют разными способами:

-в эксикаторе или анаэростате со свечой. После того, как зажженная свеча
в герметично закрытых эксикаторе или анаэростате с посевами погаснет, кон-
центрация кислорода в них снижается не менее чем до 17%;

- в вакуумном термостате или микроанаэростате. С помощью вакуум-
насоса из герметично закрытых емкостей с посевами откачивают воздух до от-
метки на манометре 0,6 атм. и восстанавливают нормальное давление в них 
путем введения газовой смеси состоящей из 10% углекислого газа, 5% кислорода
и 85% азота;

- с использованием газогенераторных пакетов. В сосуд с посевами поме-
щают увлажненный газогенераторный пакет, после чего сосуд герметично за-
крывают. После каждого открывания сосуда, при учете результатов посевов, в
      случае продолжения культивирования в него требуется помещать новый газоге-
нераторный пакет;

- с использованием полиэтиленовых пакетов. Посевы помещают в поли-
этиленовые пакеты и заполняют их газовой смесью состоящей из 10% углеки-
слого газа, 5% кислорода и 85% азота. Затем пакет сжимают для удаления из
него воздуха, вновь заполняют его газовой смесью и герметично укупоривают.

2.4. Культуры, выделенные из патологического материала на полужидкой
среде, пересевают на плотную питательную среду.

При скудном росте культуры в среды добавляют 0,03% тиогликолята на-
трия или 0,02% l-цистеина. При необходимости в плотные среды вносят аэро-
толерантную добавку, содержащую по 0,025% пирувата натрия, метабисульфи-
та натрия и сульфата железа, которая обеспечивает возможность выращивания
кампилобактерий при наличии в атмосфере 15-20% кислорода (все компоненты
растворяются в стерильной дистиллированной воде).

На полужидкой питательной среде кампилобактерии растут в виде тонкого
нежного диска, медленно поднимающегося к поверхности среды. Через 24-48
часов культивирования диск культуры располагается под поверхностью среды,
а его толщина может достигать 1-3 мм.

На плотной питательной среде через 24-36 часов кампилобактерии растут в
виде нежного мелкороссинчатого налета или отдельных прозрачных колоний
(видимых через лупу). Через 48-72 часа они достигают 1-3 мм в диаметре. В
большинстве случае колонии круглой формы, умеренно выпуклые, прозрачные
в проходящем свете и матовые при рассмотрении сбоку.

2.5. Для идентификации используют двухсуточные культуры второй -
третьей генерации на плотной питательной среде. Культуры проверяют на чис-
тоту роста визуально и путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму или
фуксином Пфейфера.

3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ КУЛЬТУР.

3.1. Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) на стекле.

3.1.1. Для постановки реакции используют чистые обезжиренные стек-
лянные пластинки. Восковым карандашом или маркером на пластинку наносят
линии, разделяющие ее на квадраты с размером сторон около 2,0 см. Для ис-
следования одной культуры на стекле расчерчивают и нумеруют 5 квадратов
(1-5). На четыре из них в порядке возрастания номеров наносят одну каплю 
сыворотки (0,03 - 0,05 куб.см) соответственно против кампилобактерий подвида fе-
tus, venerealis, jejuni и bubulus, разведенные 0,3%-ным 
формалинизированным
3%-ным раствором хлористого натрия в соотношении 1:50, а на 5-ю - каплю
0,3%-ного формалинизированного 3%-ного раствора хлористого натрия в таком
же объеме. На стекло рядом с каждой каплей наносят испытуемую культуру в
      количестве примерно 0,1-ой части полной стандартной бактериологической
петли (2,0 мм). После каждого суспендирования культуры в капле сыворотки
или 0,3%-ного формалинизированного 3%-ного раствора хлористого натрия
петлю прожигают и охлаждают. Учет реакции проводят визуально на темном
фоне в течение 2 мин. после суспендирования культуры.

3.1.2. Положительная реакция характеризуется появлением агглютината в
виде мелких комочков или хлопьев и просветлением жидкости, при этом сус-
пензия, идентифицируемой культуры в 0,3-ном формалинизированном 3%-ном
растворе хлористого натрия должна оставаться гомогенной, что считается 
отрицательным результатом.

3.1.3. Результаты исследования культуры в пластинчатой РА являются
ориентировочными. При положительном результате исследования культуры с
одной или несколькими сыворотками ее идентифицируют в пробирочной РА с
теми же сыворотками.

3.2. Постановка и учет результатов РА в пробирках.

3.2.1. Чистую культуру смывают с плотной питательной среды 0,3%-ным
формалинизированным физиологическим раствором. Полученную взвесь мик-
робных клеток выдерживают при комнатной температуре в течение 24 час. для
инактивирования и отмывают идентичным раствором путем центрифугирова-
ния при 3 тыс. об/мин. в течение 30 мин.

3.2.2. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а оса-
док суспендируют в 0,3%-ном формалинизированном 3%-ном растворе хлори-
                                                                                        
9
стого натрия с таким расчетом, чтобы в 1,0 куб.см взвеси содержался 10 
микробных клеток по оптическому стандарту мутности ГИСК. Антиген, приготовлен-
ный из идентифицируемой культуры, исследуют в пробирочной РА, которую
ставят в объеме 1,0 куб.см (0,5 куб.см сыворотки + 0,5 куб.см антигена).

3.2.3. Каждую из моноспецифических агглютинирующих сывороток раз-
водят 0,3%-ным формалинизированным 3%-ным раствором хлористого натрия
последовательно двукратно от 1:25 до 1:200.

Антиген встряхивают и вносят в пробирки со всеми разведениями сыво-
ротки.

Для контроля на самоагглютинацию по 0,5 куб.см антигена вносят в пробир-
ку с 0,5 куб.см нормальной сыворотки крови кролика в разведении 1:25 и в 
пробирку с 0,5 куб.см 0,3%-ного формалинизированного 3%-ного раствора хлористого
натрия.

3.2.4. Пробирки с реагентами встряхивают и помещают в термостат при
температуре (37-38)гр.С на 16-18ч., после чего выдерживают их при 
температуре (18-22)гр.С в течение 1 ч. и проводят учет результатов реакции.

3.2.5. Результаты реакции учитывают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) - полное просветление жидкости над агглютинатом в виде
"рыхлого зонтика", полностью покрывающего дно пробирки. При встряхивании
      "зонтик" поднимается в виде паутинки и разбивается на крупные хлопья или
комочки, а надосадочная жидкость остается прозрачной;

+++ (3 креста) - просветление жидкости со слабо выраженной опалесцен-
цией над агглютинатом в виде "рыхлого зонтика", полностью покрывающего
дно пробирки. При встряхивании "зонтик" поднимается в виде паутинки и раз-
бивается на хлопья или комочки средней зернистости, а надосадочная 
жидкость становится слегка мутной;

++ (2 креста) - заметное просветление жидкости над агглютинатом в виде
"компактного зонтика", покрывающего около 50% площади дна пробирки. При
встряхивании "зонтик" разбивается на мелкие хлопья или комочки, а надоса-
дочная жидкость становится мутной;

+ (1 крест) - слабо выраженное просветление жидкости над агглютина-
том в виде "компактного зонтика", занимающего около 25% площади дна про-
бирки. При встряхивании агглютинат разбивается на мельчайшие плохо види-
мые комочки, надосадочная жидкость мутная;

- (минус) - просветление жидкости и образование агглютината не регист-
рируется. На дне пробирки в центре может быть осадок из микробных клеток,
при встряхивании поднимающийся в виде косички.

Положительной считается реакция с оценкой на 3-4 креста.

3.2.6. Результаты РА учитывают только после получения отрицательного
результата контроля антигена на самоагглютинацию с нормальной кроличьей
сывороткой и с 0,3%-ным формалинизированным 3%-ным раствором хлори-
стого натрия. Если результат контроля антигена на самоагглютинацию положи-
тельный реакцию переставляют с использованием вновь приготовленного ан-
тигена.

3.2.7. При получении положительной реакции антигена из идентифици-
руемой культуры с одной моноспецифической агглютинирующей сывороткой
культуру относят к подвиду кампилобактерий к которым эта сыворотка была
получена.

3.2.8. При получении положительной реакции антигена одновременно с
несколькими моноспецифическими агглютинирующими сыворотками, что мо-
жет иметь место при выделении атипичных или диссоциированных культур, ре-
акцию ставят повторно с этими же сыворотками, разведенными до предельного
титра. Подвидовая принадлежность идентифицируемой культуры устанавлива-
ется по той сыворотке, которая агглютинировала антиген в более высоком 
титре.

4. Для контроля активности и специфичности антигена для РАВС исполь-
зуют моноспецифические агглютинирующие сыворотки против кампилобакте-
рий подвида venerealis и bubulus. Метод контроля представлен в наставлении
по применению антигена.

      5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ.

5.1. В случае несоответствия препарата требованиям, указанным в на-
стоящем наставлении, снижения активности или специфичности, применение
сывороток данной серии прекращают и, в соответствии с указанием Главного
управления ветеринарии Минсельхоза России от 8 мая 1992 года №22-7/28 "0
порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производ-
ства и закупаемые по импорту", сообщают об этом предприятию изготовителю,
Всероссийскому государственному научно-исследовательскому институту кон-
троля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов - ВГНКИ
(123022, Москва, Д-22, Звенигородское шоссе, 5) и Центральной научно-
методической ветеринарной лаборатории - ЦНМВЛ (111622, Москва, Оранже-
рейная, 23).

Одновременно в ВГНКИ направляют 3 ампулы (флакона) сывороток дан-
ной серии.

С утверждением настоящего наставления утрачивает силу "Наставление
по применению сывороток кампилобактериозных моноспецифических агглю-
тинирующих" №13-7-2/192, утвержденное 29.01.1998 г. Департаментом ветери-
нарии Минсельхозпрода РФ.

Наставление разработано ВГНКИ.