МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Начальник Управления ветеринарии ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ n 22-7/37 3 июня 1992 г. НАСТАВЛЕНИЕ по применению набора ком- понентов для диагностики инфекционного эпидидимита баранов методом иммунофер- ментного анализа (ИФА) 1. Набор предназначен для выявления специфических антител в сыворотке крови при диагностике инфекционного заболевания овец, вызываемого возбудителем Бруцелла овис (инфекционный эпидидимит баранов), методом иммуноферментного анализа. 2. Компоненты, входящие в набор, выпускаются во флаконах (ампулах). В состав набора входят: Реагент № 1 - плашки одноразовые, 96-ти луночные из полистирола, сенсибилизированные овисным антигеном 4 шт. Реагент № 2 - конъюгат - ангитела диагностичес 1 ампула кие против иммуноглобулина барана, (флакон) меченые пероксидазой, сухие 0,2 мл Реагент № 3 - позитивная овисная сыворотка, 1 флакон сухая 0,2 мл Реагент № 4 - негативная сыворотка, сухая 1 флакон 0,2 мл Реагент № 5 - калий фосфорнокислый, 1-заме- 1 флакон щенный 0,68 г Реагент № 6 - калий фосфорнокислый 2-заме- 1 флакон щенный 4,56 г Реагент № 7 - натрий хлористый 1 флакон 21,9 г Реагент № 8 - 0,2 М раствор фосфорнокис- 1 флакон лого натрия 1-замещенного 12,8 мл Реагент № 9 - 0,1 М раствор лимонной 1 флакон кислоты 12,2 мл Реагент № 10 - ортофенилендиамин 1 флакон 20 мг Реагент № 11 - 3%-ная перекись водорода 1 флакон 1,0 мл Реагент № 12 - Твин-20 1 флакон 1,25 мл Компоненты набора должны быть упакованы в картонные коробки с этикеткой в соответствии с ТУ. В каждую коробку должно быть вложено наставление по применению набора. Срок годности набора - один год со дня изготовления при условии хранения в темном сухом месте при температуре 2-8С. 3. Подготовка реагентов для анализа на 4-х плашках. 3.1. Приготовление буферного физиологического раствора для раз- ведения сывороток, конъюгата и промывания плашек. Содержимое флаконов с маркировкой "Реагент № 5, 6 и 7" разводят в 2,5 литрах дистиллированной воды, затем в 50 мл полученного раствора после нагревания до 40С разводят "Реагент № 12" и смешивают с основ- ным объемом. 3.2. Разведение контрольных и исследуемых сывороток. Контрольные сухие позитивную овисную (реагент № 3) и негативную сыворотки (реагент № 4) растворяют в 0,2 мл забуференного физиологичес- кого раствора. В пробирки Флоринского вносят в первый ряд по 0,45 мл; во второй - по 0,45 мл и в третий - по 0,3 мл буферного раствора (п. 3.1.). После этого в первый ряд вносят по 0,05мл каждой сыворотки, тщатель- но перемешивают и переносят по 0,05 мл во второй ряд тщательно пере- мешивают и переносят 0,1 мл в третий ряд. В третьем ряду пробирок по- лучают разведение 1:400. 3.3.Готовят разведение конъюгата. Для этого содержимое ампулы (реа- гент №2)растворяют в 2,0 мл буферного раствора. Данный концентрирован- ный раствор конъюгата (1:10) можно хранить не более З-х недель при 4С или в замороженном виде в пределах срока годности набора. Перед внесением в лунки готовят рабочее разведение конъюгата.Для этого 1 мл концентрированного раствора разводят в 49 мл буферного раствора, получая при этом конечное разведение 1:500. 3.4.Непосредственно перед внесением в лунки готовят субстратную смесь.Для этого к содержимому флакона"Реагент №8"добавляют содержимое флакона "Реагент № 9", доводят до 50 мл дистиллированной водой,тщатель- но перемешивают, высыпают содержимое флакона "Реагент №10" и после его полного растворения добавляют перекись водорода из флакона "Реа - гент №11". 4.Подготовка реагентов для анализа на одной плашке* 4.1. Приготовление буферного физиологического раствора для разве- дения сывороток,конъюгата и промывания плашки. "Реагенты № 5,6 и 7" разводят в 100 мл дистиллированной воды, 20 мл полученной смеси доводят водой до 500 мл и добавляют 0,25 мл Твина-20. Полученного объема достаточно для промывки плашки, разведения конъюга- та и сывороток.Оставшиеся 80 мл концентрата реагентов 5,6 и 7 хра- нят в замороженном виде и используют по мере надобности. 4.2.Разведение контрольных и исследуемых сывороток (реагенты 3 и 4) Сыворотки разводят как указано в п.3.2., но для последующего использо- вания остатки контрольных сывороток из набора хранят в замороженном виде. 4.3.Разведение конъюгата. Реагент №2 разводят как указано в п.3.3. Перед внесением в лунки готовят рабочее разведение, для этого отби- рают 0,2 мл из разведения 1:10 и доводят до 10 мл буферным раствором. Полученное разведение 1:500 используют в анализе. 4.4.Приготовление субстратной смеси. Непосредственно перед применением смешивают "Реагенты № 8 и 9", к 5 мл смеси добавляют 5 мл воды и 5 мг "Реагента 10", после полного растворения которого добавляют 0,2 мл "Реагента №11". Полученную субстратную смесь используют в анализе. После вскрытия ампулы "Реагент № 11" хранению не подлежит и для последующей работы 3%-ную Н2О2 сле- дует приобрести в аптеке. Оставшуюся смесь "Реагентов № 8 и 9" хранят в замороженном виде и используют по мере надобности. 5.Постановка ИФА. 5.1.Вскрывают пакеты с плашками (реагент № 1). Ряд-1 на плашке ос- тавляют для контроля, во все остальные лунки вносят исследуемые сыво- ротки в разведении 1:400 по 0,1 мл в каждую лунку в двух повторностях, т.е. 44 пробы сыворотки в одну плашку. 5.2.Контроль активности и специфичности антигена. В лунки a-l,b-l,g-l и Н-1 вносят по 0,1 мл буферного раствора (п.3.1) (контроль на неспецифическое окрашивание). В лунки С-1 и Д-1 вносят по 0,1 мл положительной овисной сыворотки в разведении 1:400 (контроль активности антигена). В лунки Е-1 и f-l вносят по 0,1 мл негативной сыворотки в разведе- нии 1:400 (контроль специфичности). 5.3.Плашки накрывают крышкой и инкубируют в течение часа при ком- натной температуре. Сыворотки из плашки удаляют стряхиванием и промы- вают 2-3 раза водопроводной водой и 2-3 раза буферным раствором,остат- ки влаги из плашки стряхивают легким постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге или полотенцу. Конъюгат в количестве 0,1 мл вносят в каждую лунку. Плашки накры- вают крышкой и инкубируют в течение часа при комнатной температуре. Отмывают как указано выше. Затем в лунки разливают по 0,1 мл приготов- ленную субстратную смесь и инкубируют при комнатной температуре. 6.Учет результатов ИФА. 6.1.Через 10-15 минут реакцию останавливают добавлением в лунки по 0,05 мл серной кислоты, которую готовят разведением 2 мл концентри- рованной кислоты водой до 10 мл. 6.2.Результаты реакции учитывают визуально или на специальном фотоколориметре (при 492нм) и оценивают по интенсивности окрашивания продуктов реакции по следующей схеме: -визуальная оценка реакции ++++ (четыре креста) -интенсивное ярко-оранжевое окрашивание +++ (три креста) - оранжевое окрашивание(как в лунках С и Д) ++ (два креста) -светло-желтое окрашивание * (один крест) слабое желтоватое окрашивание (как в лунках Е и f), - (минус) -окрашивание отсутствует(как в лунках А, В, g и Н). -учет реакции на фотоколориметре проводят при 492 нм, установив ноль прибора по лунке А-1. Положительной считается такая сыворотка, величина оптической плотности которой в два и более раза превышает оптическую плотность нормальной сыворотки (как в лунках Е и f). 7.Диагностическая оценка ИФА. 7.1.Реакцию считают положительной при наличии в лунке продукта реакции с окраской оранжевого цвета с оценкой не ниже, чем на три креста или при оптической плотности продукта реакции в 2 раза превы- шающей плотность нормальной сыворотки, лунки Е и f. Реакцию считают отрицательной при наличии светло-желтого (++,+) окрашивания в лунках с исследуемой и негативной сыворотками, оптичес- кая плотность не превышает в 2 раза плотность в лунках Е и f. В заключении лаборатории о результатах исследования указывают диагностическую оценку каждой пробы (положительная, отрицательная) и показания в крестах. 7.2.В хоэяйствах (фермах, отарах), неблагополучных по инфекционому заболеванию овец, вызываемому возбудителем Бруцелла овис, животных, при исследовании сыворотки крови которых получен положительный ре- зультат в ИФА, признают больными и сдают на убой. 7.3.Если в хозяйствах (фермах,отарах), на станциях или предприяти- ях по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, благо- получных по инфекционному заболеванию овец, вызываемому возбудителем Бруцелла овис, у отдельных баранов(овец)получена положительная реак- ция в ИФА, их немедленно изолируют и принимают меры по установлению или исключению заболевания. Для этого часть реагирующих животных подвергают убою и проводят исследование биоматериала в РНАт с целью выявления бруцелл вида овис. Отбор проб биоматериала и его исследова- ние проводят в сортветствии с "Наставлением по диагностике инфекцион- ной болезни овец, вызываемой Бруцелла овис (инфекционный эпидидимит баранов)", утвержденному ГУБ Минсельхозпрода СССР 13.11.1991г. При выделении в отаре до трех реагирующих животных, убою подвергают всех реагирующих, а при выделении четырех и более голов-убою подвергают не менее трех животных. При получении положительного результата в РНАт диагноз на инфекцион- ный эпидидимит баранов считают установленным, а хозяйство объявля- ют неблагополучным по данной инфекции. При получении отрицательного результата по всем исследованным животным хозяйство считают благо- получным. 8.Рекламации на качество набора следует направлять во Всероссий- ский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе 5, ВГНКИ) и биопредприятию-изготовите- лю в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Минселъхоза Рэссии "О порядке предъявления рекламаций на ветпрепа- раты отечественного производства и закупаемые по импорту".