Наставление
по применению набора "ХламиОрн"
для выявления родоспецифического антигена
хламидий методом прямой иммунофлюоресценции
у животных и птиц
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
2. МЕХАНИЗМ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ
3. ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ
4. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПИФ
5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/1594 от 05 мая 1999 г. В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора "ХламиОрн"
для выявления родоспецифического антигена
хламидий методом прямой иммунофлюорес-
ценции у животных и птиц
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Диагностический набор применяют для постановки реакции
прямой иммунофлюоресценции с целью выявления хламидийного
родоспецифического антигена хламидий в патологических образцах от
носителей и больных хламидиозом животных и птиц. Диагностикум
предназначен для проведения 100 анализов.
1.2. Набор включает:
Компонент №1 - лиофилизированные моноклональные антитела,
меченные флюоресцеин-изотиацианатом (ФИТЦ) и содержащие
краситель Эванса; сухая гомогенная аморфная масса синевато-
сиреневого цвета -1 флакон, 0,1 куб.см.
Компонент №2 - растворитель для лиофилизированных антител,
прозрачная бесцветная жидкость -1 флакон, 3,0 куб.см.
Компонент №3 - жидкость для "заключения" препарата, вязкая
прозрачная маслянистая жидкость -1 флакон, 2,0 куб.см.
1.3. Упаковка, маркировка
1.3.1. Все компоненты набора расфасовывают в стеклянные
флаконы, укупоренные резиновыми пробками, и закатывают
металлическими колпачками.
1.3.2. На флаконы наклеивают этикетки, на которых указано:
наименование диагностического набора; наименование компонента и
его номер; объем компонента во флаконе (куб.см); номер серии; номер
контроля; дата изготовления; срок годности.
1.4. Флаконы упаковывают в картонную коробку, в которую
вкладывают наставление по применению препарата.
1.5. На картонную коробку с набором наклеивают этикетку, на
которой указаны следующие обозначения: наименование предприятия-
изготовителя и его товарный знак; наименование набора; состав набора;
номер серии; номер контроля; количество препарата во флаконе (куб.см);
условия хранения; дата изготовления; срок годности; обозначение ТУ.
1.6. Набор хранят в сухом, темном месте при температуре от 2 до
10 °С. Срок годности набора -18 мес. с даты изготовления.
1.7. При нарушении целостности флаконов набора, изменении
цвета его компонентов, отсутствии этикеток набор не применяют.
2. МЕХАНИЗМ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ
Реакция прямой иммунуфлюоресценции основана на
взаимодействии моноклональных антител, меченных ФИТЦ, с
родоспецифическим хламидийным антигеном, результатом которого
является специфическое ярко-зеленое свечение. Результат реакции
оценивают визуально при помощи люминесцентного микроскопа.
3. ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ
3.1. Необходимое оборудование:
- люминесцентный микроскоп;
- термостат на 37 °С;
- чашки Петри;
- предметные стекла с лункой;
- фильтровальная бумага;
- микропипетка на 30 мкл;
- наконечники в штативе.
3.2. Приготовление и фиксация мазков-отпечатков .
Мазки готовят непосредственно после взятия материала с
коньюнктивы, гениталий животных и клоаки у птиц, используя
одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной адсорбцией.
Материал отбирают вращательным движением тампона и переносят на
лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют,
указывая номер и дату взятия пробы. Приготовленный мазок
высушивают на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в
течение 5 мин. или наносят на мазок 2-3 капли ацетона до полного его
испарения. Стекло с фиксированным препаратом может храниться при
температуре 18-20° С в течение 5 сут.
3.3. Приготовление растворов №1 и №2
Содержимое флакона с моноклональными антителами (компонент
№1) и флакона с растворителем (компонент №2), смешивают и
растворяют в течение 1-2 мин при температуре 18-20 °С, слегка
встряхивая флакон. Растворенный реагент хранят в холодильнике при
температуре 2-10 °С в течение 6 недель. Замораживание допускается в
течение 12 мес.
3.4. Постановка ПИФ.
3.4.1. Нанесение реагента на мазок
30 мкл реагента с помощью микропипетки вносят в специальную
лунку предметного стекла. С помощью наконечника пипетки или
запаянной пастеровской пипетки равномерно распределяют реагент по
всей поверхности лунки с материалом.
3.4.2. Инкубация мазков-отпечатков
Мазки с нанесенным на них реагентом инкубируют во влажной
камере (в чашке Петри) при температуре 37±0,5 °С в течение 30 мин,
периодически проверяя их состояние во избежание высыхания реагента
на препарате, что может привести к ложноположительным результатам
при диагностике, поэтому высохшие препараты бракуются.
3.4.3. Промывание предметных стекол
По истечении срока инкубации предметные стекла тщательно
промывают дистиллированной водой в течение 10 с., остатки воды
удаляют с краев стекла фильтровальной бумагой и высушивают на
воздухе.
3.4.4. Микроскопирование мазков
На мазок наносят 20 мкл жидкости для "заключения" препарата
(компонент №3), покрывают обезжиренным покровным стеклом и
просматривают препарат в люминесцентном микроскопе при
комбинации светофильтров СЗ 24-3, ФС 1-2, БС 8-3 при использовании
окуляра Х 10 и объектива с масляной иммерсией Х 90, с использованием
нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Препарат рекомендуется
просматривать сразу же после приготовления. Смонтированные
препараты можно хранить при температуре 2-10 ° С не более 24 ч.
4. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПИФ
4.1. Диагноз на хламидиоз считается положительным, если в
препарате диагностируют наличие элементарных телец хламидий,
расположенных внеклеточно и представляющих собой ярко-зеленые
образования округлой формы с ровными краями, размером около 300
мкм (приблизительно 1/100 от окружающих эпителиальных клеток).
Иногда наблюдаются ретикулярные тельца хламидий, размеры которых
в 2-3 раза больше элементарных. Внутриклеточные включения
выявляются не более, чем в 10% случаев.
4.4. Диагноз на хламидиоз считается отрицательным, если в
препарате отсутствует специфическое ярко-зеленое свечение при
наличии окрашенных в красный цвет эпителиальных клеток. Для того,
чтобы отрицательный диагноз можно было считать достоверным,
рекомендуется просматривать все поле мазка не менее 5 мин.
4.5. В качестве отрицательного контроля проводят микроскопию
мазков, приготовленных из коньюнктивы заведомо здоровых животных,
специфическое ярко-зеленое свечение при наличии красных
эпителиальных клеток должно отсутствовать.
Любой флюоресцирующий материал неправильной формы или
другого цвета, а также имеющий неяркую зеленую окраску,
рассматривается как артефакт.
5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
В случае несоответствия препарата требованиям, указанным в
настоящем наставлении, применение данной серии препарата
прекращают и, в соответствии с указанием Главного Управления
ветеринарии Минсельхозпрода России от 8 мая 1992 г. №22-7/28 "О
порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного
производства и закупаемые по импорту", сообщают об этом
предприятию-изготовителю, Всероссийскому Государственному научно-
исследовательскому институту контроля, стандартизации и
сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва,
Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ) и Центральной научно-методической
ветеринарной лаборатории (111622, Москва, Перовский район,
Оранжерейная ул., 23, ЦНПВЛ).
В адрес института высылается один невскрытый набор с
сопроводительным письмом.
Наставление разработано Всероссийским Государственным
научно-исследовательским институтом контроля, стандартизации и
сертификации ветеринарных препаратов.
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 19.02.1999 г.,
протокол №1, № ПВР-1-1.9/00044
Начальник отдела ветеринарно-
санитарной экспертизы и
лабораторной диагностики В.И.Белоусов