Наставление
по применению тест-системы
«БРУ-КОМ» для диагностики бруцеллеза
методом полимеразной цепной реакции
1. Общие положения
2. Отбор материала для исследования
3. Подготовка исследуемого материала
4. Проведение ПЦР-анализа
5. Учет и интерпретация результатов
6. Оценка результатов
7. Предъявление рекламаций
Таблица 1
Интерпретация результатов анализа
Таблица 2
Учет результатов амплификации контрольных образцов
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
УТВЕРЖДАЮ
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ Заместитель руководителя
Департамета ветеринарии
№ 13-7-2/1580 от 26 апреля 1999 г. В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы
«БРУ-КОМ» для диагностики бруцел-
леза методом полимеразной цепной
реакции
1.Общие положения
1.1.Тест-система предназначена для выявления ДНК бактерий рода
brucella (b.melitensis, b.abortus, b.ovis, b.canis) в биологическом материале
от животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами и использу-
ется в случае аборта или проявления у животных других признаков (бурситы, гиг-
ромы, орхиты, эпидидимиты), вызывающих подозрение на данное заболевание и
(или) при получении положительных и сомнительных результатов серологического
исследования на бруцеллез.
В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в
исследуемой пробе при температуре 95 гр.С, отжига специфических олигонуклео-
тидных затравок (праймеров) при температуре 65 гр.С и синтеза комплементарных
цепей ДНК с помощью фермента при температуре 72 гр.С.
В данной тест-системе используется неконкурентный внутренние стандарт
(фрагмент ДНК фага лямда, позволяющий контролировать эффективность протекания
всего процесса для каждой исследуемой пробы.
В состав тест-системы, рассчитанной на проведение 100 анализов, входят:
- набор для выделения ДНК (набор №1 )
- набор для проведения ПЦР (набор №2)
- набор для элеетрофоретического анализа продуктов ПЦР(набор №3)
1.2. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
Лизирующий раствор - 1 флакон, 30,0 мл
Отмывочный раствор №1 - 1 пробирка. 20,0 мл
Концентрат для отмывочного раствора №2 - 1 пробирка, 20,0 мл
Суспензия сорбента - 2 пробирки по 2,0 мл
Буфер для элюции ДНК с сорбента 2 пробирки по 5,0 мл
1.3. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:
Смесь праймеров "Вru" - 1 пробирка, 0,25 мл
Смесь праймеров "ВС-Л" - 1 пробирка, 0,25 мл
Смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,5 мл
5-кратный реакционный буфер - 1 пробирка. 1.0 мл
Деионизованная вода - 1 пробирка, 2,0 мл
Фермент Таq-полимераза - 1 пробирка, 0,1мл
Положительная контрольная ДНК (ДНК Вruсе11а) - 1 пробирка, 0,2 мл
ДНК внутреннего стандарта (ДНК ВС-Л) - 1 пробирка. 1,0 мл
Воск для ПЦР - 2 пробирки по 1,0 мл
Масло минеральное - 1 пробирка. 5,0 мл
1.4. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор №3)
состоит из следующих компонентов:
Концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25,0 мл
Агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2,0 г
1.5.Тест-система должна быть упакована в картонную коробку с этикеткой, на
которой указаны: полное наименование тест-системы, перечень наборов, входящих
в него, наименование предприятия-изготовителя, номер серии, номер контроля,
дата изготовления, срок годности, условия хранения и обозначения ТУ. В каждую
упаковку вкладывают наставление по применению тест-системы.
Внутрь коробки тест-системы вложены три запаянных полиэтиленовых паке-
та с вышеперечисленными наборами. На этикетке каждого из наборов должно быть
указано наименование набора, перечень компонентов, количество пробирок каждо-
го компонента, количество препарата в каждой пробирке, номер серии набора, да-
та изготовления, срок годности, условия хранения.
На пробирки с каждым компонентом должна быть нанесена этикетка с указа-
нием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке, номе-
ра серии и даты изготовления.
1.6.Тест-систему транспортируют и хранят при температуре 2-8 гр.С. При по-
лучении и вскрытии коробки тест-системы исследователем можно хранить набор
для выделения ДНК и набор для электофоретического анализа продуктов ПЦР -
при температуре 2-25 гр.С в темном сухом месте, а набор для проведения ПЦР - при
температуре 2-8 гр.С.
1.7.Срок годности тест-системы - 6 мес. со дня изготовления.
2. Отбор материала для исследования
2.1 .При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для иссле-
дования необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и об-
семенение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими пра-
вилами и инструкциями по данному запросу.
2.2.Материал от каждого животного отбирают отдельными пипетками и инст-
рументами.
2.3.Для исследования используют:
-содержимое брюшной полости и желудка абортируемого плода;
-плаценту и плодовые оболочки от абортировавших животных;
-содержимое бурс, гигром;
-кровь и молоко от абортировавших животных и (или) от животных, в сыворотке
которых обнаружены агглютинины и (или) комплементсвязывающие антитела.
В случае убоя животных для исследования отбирают лимфатические узлы
(парааортальные, надвымянные, паховые, гипогастральные) и кусочки парен-
химатозных органов (печень, селезенка), от самцов с признаками орхита или эпи-
дидимита отбирают семенники с придатками.
2.4.Жидкости для исследования, кроме крови, отбирают в объеме 20 мл из
тканей и органов вырезают кусочки размером 3 х 3 х 3 см (при невозможности тол-
щина кусочков может быть меньше), лимфатические узлы берут целиком.
2.5. Кровь в объеме 5-10 мл берут в пробирки с предварительно налитым
4%-ным раствором трилона Б из расчета 10:1 .
2.6. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий
день. Допускается хранение материала при минус 20 гр.С в течение 30 дней.
3. Подготовка исследуемого материала
3.1.Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипеточ-
ными дозаторами переменных объемов (типа "Ленпипет") с использованием одно-
разовых полипропиленовых пробирок на 1,5 мл и 10,0 мл (ПО "Ленполимер") и на-
конечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки,
наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезин-
фицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.
После 3-часовой выдержки раствор выливают в канализацию, а отработанный
пластик выбрасывают в мусорный контейнер.
3.2.Пробы исследуемых жидкостей, кроме крови, в объеме 10 мл (при необ-
ходимости объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологическо-
го раствора), центрифугируют при 3-10 куб.об/мин в течение 10-15 мин. Если
осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 мл материала и
повторяют центрифугирование. Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком
примерно 0,5 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной
жидкости, переносят в пробирку типа "эппендорф" и осаждают на микроцентрифу-
ге при 11-10 куб.об/мин в течение 3 мин. Супернатант удаляют, осадок
ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения
ДНК.
3.3 . Пробы цельной крови, консервированной трилоном Б, используют для
выделения ДНК без предварительной подготовки.
3.4. Пробы лимфатических узлов, паренхиматозных органов, семенников,
плодовых оболочек, плаценты (каждую отдельно) размером ЗхЗхЗ мм помещают 8
пробирки вместимостью 1,5 мл, тщательно растирают отдельными стеклянными
палочками, добавляют по 1 мл физиологического раствора и тщательно переме-
шивают. Смесь отстаивают при температуре 20-25 гр.С в течение 30 мин, после чего
верхнюю фазу переносят в пробирки типа "эппендорф" и центрифугируют при
11-10 куб.об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресус-
пендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК.
4.Проведение ПЦР-анализа
4.1. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных комнатах (зонах), для
работы в которых дополнительно требуются следующие материалы и оборудованием
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1
- 100 мл спирта этилового ректификованного по ГОСТ 5962-67
- настольный бокс с бактерицидной лампой "Циклотемп" (СП "РТС");
- термостат для пробирок типа "эппендорф"на 25-100 гр.С фирмы "Биоком";
- микроцентрифуга до (12-16) * 10 куб. об/мин ("elmi","hettish");
- центрифуга/вортекс "Мiсго-spin","Мingen" ("Биоком");
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема ("Биоком"),
- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером ("Биоком", "Хеликон");
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 мл типа "эппендорф" ("Хеликон");
- штативы для пробирок, наконечников ("Хеликон");
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- холодильник на 2-8 гр.С с морозильной камерой.
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2.
-амплификатор ("ДНК-технология", "Реrkin Еlmеr"),
- ПЦР-бокс "Циклотемп" (СП"РТС") или отдельный стол с УФ-лампой,
- отдельный халат и одноразовые перчатки.
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема ("Биоком");
- одноразовые наконечники в штатива ("Биоком");
- одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл ("Хеликон"),
- штативы для микропробирок на 0,5 мл ("Хеликон");
- холодильник на 2-8 гр.С, морозильник на минус 20 гр.С для выделенных ДНК;
- термостат для микропробирок с воском на 95 гр.С ("Биоком").
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3.
- камера для горизонтального электрофореза ("Хеликон", "ДНК-технологи")на 50
проб;
- источник постоянного тока на 150-200 В ("ДНК-технология");
- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей ("Биоком");
- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка "Микрат-ЗОО";
- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
- аквадистиллятор;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатка;
- отдельная автоматическая пипетка на 10-40 мкл и наконечники в штативе;
- мерный цилиндр на 1л;
- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агароэы;
- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
4.2.Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала
Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного материала проводят с помощью
набора №1. Предварительно готовят отмывочный раствор №2, смешав в отдель-
ном флаконе 20,0 мл концентрата из набора, 8О,О мл дистиллированной воды и
100,0 мл 96%-ного этилового спирта. Смесь хорошо перемешивают и хранят при
температуре 20-22°С под плотно закрытой крышкой. Проверяют состояние сорбен-
та - при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема сус-
пензии. После этого приступают к выделению ДНК.
В ряд полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл вносят по 100 мкл пред-
варительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контрольных
проб 1-го этапа анализа ("контролей выделения"): отрицательные пробы - элюи-
рующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае подготовки
пробы с его использованием), положительная проба - ДНК Вrucella (из набора
№ 2), разведенная 1:10 элюирующим буфером (90 мкл+10 мкл).
Добавляют по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным
наконечником с аэрозольным барьером) и тщательно пипетируют 5-10 раз до пол-
ного лизиса пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор.
В лизированный материал добавляют по 10 мкл ДНК ВС-Л. Прогревают про-
бирку в термостате 5 мин при 65°С, тщательно перемешивают на вортексе до пол-
ного растворения материала.
Добавляют по 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую
пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают содержимое пробирки
на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбента, еще раз пе-
ремешивают и отстаивают 5-7мин.
Осаждают сорбент на центрифуге-вортексе в течение 30 с и удаляют супер-
натант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать ваку-
умный отсос с колбой-ловушкой для отбираемой жидкости).
Вносят по 200 мкл отмывочного раствора №1, перемешивают на вортексе до
полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его разбивают
при помощи наконечника пипетки), осаждают на центрифуге-вортексе 30 с и уда-
ляют супернатант.
Вносят по 900 мкл отмывочного раствора №2, перемешивают на вортексе до
полного ресуспендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10*10куб.
об/мин в течение 30 с, удаляют супернатант.
Повторяют процедуру отмывки раствором №2, тщательно удаляют суперна-
тант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в термостате
при 65 гр.С в течение 5-7мин.
Вносят по 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в тер-
мостат при 65 гр.С на 5 мин, встряхивая на вортексе каждую через минуту.
Осаждают на микроцентрифуге при 10*10куб. об/мин в течением мин.
Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.
ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК)
Пробирку с воском ставят в термостат при 95 гр.С до полного расплавления.
Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя стерильные наконечники
(полистирол выдерживает автоклавирование при 120 гр.С в течение 15 мин);
- для амплификации ДНК Вrucella: к 0,25 мл праймеров Вrucella добавляют 0,25
мл нуклеотидов, смешивают на вортексе:
- для амплификации ДНК ВС-Л: к 0,25 мл праймеров ВС-Л добавляют 0,25 мл
нуклеотидов, смешивают на вортексе.
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают
сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость,
закрывают крышки, на верхней части которых наносят пометки "Вru" или "ВС-Л".
Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают пробирки в
амплификаторе 5 мин при 95 гр.С и охлаждают. В таком виде пробирки хранятся в
морозильнике несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.
Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 мл 5-кратного реакционного буфера добавляют
0,45 мл деионизованной воды и 0,05 мл Таq-полимеразы, хорошо перемешивают на
вортексе. Смесь хранится при 2-8°С в течение месяца (не замораживать!).
Ставят два ряда пробирок с "нижними" смесями ("Вru" и "ВС-Л") в штатив по
числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли
выделения" ), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода, ДНК
Вrucella и ДНК ВС-Л, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их в
нижней части крышки.
Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, при
этом она не должна протекать под воск и смешиваться с "нижней" смесью. В против-
ном случае пробирку считают браком и выбрасывают.
Сверху раскапывают по 1 капле минерального масла.
Под масло вносят по 10 мкл проб - испытуемых и контрольных двух этапов
анализа (для каждой пробы две пробирки - из ряда "Вru" и ряда "ВС-Л").
Набирают на амплификаторе нужную программу:
Амплификаторы с регулированием
температуры по матрице (скорость
нагрева-охлаждения-не менее 1 гр.С/сек
"Ампли-3" (Биоком)
"Мinicycler", "РТС-100" (mj research)
|
Амплификаторы с активным регулированием
(по раствору в пробирке)
"gene amp psr system 2400" (perkin elmer)
"omn-e" (hibaid)
"Терцик" (ДНК-технология)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-1 мин.,
65 гр.С-1 мин.,
72 гр.С-1 мин. 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-10 с,
65 гр.С-10 с,
72 гр.С-10 с 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
Через 1-2 мин после запуска программы, когда температура в ячейке амплифи-
катора достигнет 95гр.С, ставят программу на паузу, помещают пробирки в ячейки,
закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут окончания реакции (примерно 2,5
часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице и 1ч 40с на
амплификаторе с активным регулированием).
Длина амплифицироаанного специфического фрагмента:
- ДНК бактерий рода Вrucella - 210 п.н.
- ВС-Л -500п.н.
После окончания реакции (в тот же день или после хранения утром следующего
дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату (зону 3) для
анализа продуктов ПЦР, который проводится разделением фрагментов ДНК в агароз-
ном геле.
ЭТАП 3.- электрофоретический анализ продуктов ПЦР
Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной
комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим мани-
пуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических
лабораториях, использующие метод полимеразнои цепной реакции. Основные по-
ложения.", утвержденные 27 января 1997 г., Мо 13-7-2/840.)
В мерный цилиндр наливают 25,0 мл концентрированного буфера, доводят
дистиллированной водой до 500,0 мл, закрывают цилиндр парафинированной
пленкой (parafilm) и перемешивают.
Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из тер-
мостойкого стекла объемом 250,0 мл, наливают 100,0 мл приготовленного буфера
и плавят на кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого
кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу.
Заливают агарозный гель в форму по размеру используемой камеры (тол-
щина 5-6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга. После
полного застывания геля (примерно 30 мин ) осторожно вынимают гребенки, не по-
вредив лунки. Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру лунками
в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок должна двигаться к положи-
тельному электроду). Наливают приготовленного буфера столько, чтобы он покрыл
гель на 4-5 мм.
Ставят пробирки с продуктами амплификации в штатив последовательно в
два ряда (на основе праймеров "Вru" и "ВС-Л")- Из под слоя масла отбирают 15 мкл
амплификата и вносят на дно лунки (например, амплификат пробы №6 из ряда
"Вru" вносят в одну полосу геля, затем амплификат той же пробы из ряда "ВС-Л" -
в другую полосу. Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пилотируя
1-2 раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока соблюдая полярность. Если нет нару-
шения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пу-
зырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента,
как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля.
Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, располо-
жив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под
другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультра-
фиолетовым излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной мас-
кой или стеклянной пластиной)
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в прохо-
дящем ультрафиолете на поляроидную пленку или "Микрат 300". Документирова-
ние результатов можно проводить с помощью других систем: insta doc i, insta doc
ii фотографирующие), gel dос 1000 или Шатер ДВ (компьютерные).
5.Учет и интерпретация результатов
5.1.Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов амплифи-
кации ДНК внутреннего стандарта. Все амплификаты ВС-Л (за исключением
"контролей ПЦР" - ДНК Вruce11а и деионизованная вода) должны содержать полосу
500 п.н. Если в дорожке какой-либо исследуемой пробы полоса внутреннего
стандарта отсутствует, то отрицательный результат анализа данной пробы на ДНК
Вrucella учитывать нельзя.
Положительные пробы должны содержать специфическую светящуюся полосу
большей или меньшей интенсивности строго на том же уровне, что и полоса с
положительным контрольным образцом ДНК Вruсе11а. В ярко положительных пробах
межет отсутствовать полоса ВС-Л и результат учитывают как положительный при
условии правильного учета результатов анализа "контролей" см. таблицы 1 и 2.
Отрицательными считаются пробы, которые содержат только полосу ВС-Л.
Кроме полос 210 п.н. и 500 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размы-
тые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п. в нижней
части дорожки).
Таблица 1
Интерпретация результатов анализа
Результат
ПЦР-анализа
|
результат амплификации исследуемой пробы
|
.
|
с праймерами на
ДНК ВС-Л
|
с праймерами на
ДНК brucella
|
положительный
|
+
|
+
|
положительный
|
-
|
+
|
отрицательный
|
+
|
-
|
недействительный
|
-
|
-
|
Таблица 2
Учет результатов амплификации контрольных образцов
.
|
Название реагента
|
с праймерами
"ВС-Л"
|
с праймерами
"bru"
|
"контроли"
1-го этапа
|
физиологический раствор
|
+
|
-
|
.
|
элюирующий буфер
|
+
|
-
|
.
|
ДНК brucella 1:10
|
+
|
+
|
"контроли"
2-го этапа
|
ДНК brucella 1:10
|
-
|
+
|
.
|
ДНК ВС-Л 1:10
|
+
|
-
|
.
|
деинизированная вода
|
-
|
-
|
Если результаты анализа контрольных образцов не совпадают с приведенными
в таблице 2, то анализ считают недействительным и исследование повторяют.
При работе с материалом, содержащим большое количество клеток, напри-
мер, кровь, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК.
При этом в дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно распола-
гающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки.
На фоне такого шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в
отрицательном образце полоса отсутствует.
5.2. Результаты анализа не учитываются, если:
- В дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повто-
рить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на
первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очист-
ке от ингибиторов реакции.
- В дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая
полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК
или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы (1 и 2 эта-
пы). Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных
контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для вы-
явления источника контаминации. Если результат повторяется, необходимо сме-
нить реактивы.
- В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Воз-
можные причины: неправильное проведение "горячего старта" или неверный тем-
пературный режим в ячейках амплификатора.
6. Оценка результатов
При положительном результате ПЦР, зарегистрированном при исследовании
хотя бы одной пробы материала, животное считают больным бруцеллезом.
При отрицательных результатах ПЦР, зарегистрированных при исследова-
нии патологического материала от абортированных плодов, абортировавших жи-
вотных и (или) крови, молока, лимфатических узлов и паренхиматозных органов от
животных с положительной серологией (РБП, РА, РСК, РДСК, РНГА, КР с молоком),
аллергией, диагноз на бруцеллез считается не установленным.
7. Предъявление рекламаций
В случае несоответствия препарата указанным в настоящем наставлении
требованиям, использование тест-системы прекращают и данную серию препарата
направляют с нарочным (или пересылают) во Всероссийский Государственный на-
учно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации вете-
ринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) и в Центральную
научно-методическую ветеринарную лабораторию (111622, Москва, Оранжерейная
ул., 23) в соответствии с указанием ГУБ Минсельхоза России "О порядке предъяв-
ления рекламации на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по
импорту" № 227/28 от 8 мая 1992 года. Второй экземпляр сопроводительного пись-
ма направляют на предприятие-изготовитель.
Наставление разработано Всероссийским Государственным научно-иссле-
довательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных
препаратов, Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 17.12.98 г., протокол № 5,
№ ЦБР 1.05.0866-98.
Начальник отдела ветеринарно-
санитарной экспертизы и лабо-
раторной диагностики В.И.Белоусов