Наставление
по применению тест-системы
«ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя
хламидиоза Сhlamydia psittaci
методом полимеразной цепной реакции
1. Общие положения
2. Отбор материала для исследования
3. Подготовка исследуемого материала
4. Проведение ПЦР-анализа
5. Учет и интерпретация результатов
6. Предъявление рекламаций
Таблица №1
Интерпретация результатов анализа
Таблица №2
Учет результатов амплификации контрольных образцов
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/1578 от 26 апреля 1999 г. В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы
«ХЛА-ПСИТ» для выявления возбуди-
теля хламидиоза Сhlamydia psittaci
методом полимеразной цепной реак-
ции
1. Общие положения.
1.1. Тест-система предназначена для выявления ДНК Сhlamydia psittaci
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в биологическом материале от животных
и птиц. В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в
исследуемой пробе при температуре 95°С, отжига специфических олигонуклеотидных
затравок (праймеров) при температуре 62 гр.С и синтеза комплементарных цепей ДНК
с помощью фермента при температуре 72°С.
В данной тест-системе используется неконкурентный внутренний стандарт
(фрагмент ДНК фага лямда, позволяющий контролировать эффективность протекания
всего процесса для каждой исследуемой пробы.
В состав тест-системы, рассчитанной на проведение 100 анализов, входят:
- набор для выделения ДНК (набор №1 )
- набор для проведения ПЦР (набор № 2)
- набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР(набор № 3)
1.2. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
Лизирующий раствор - 1 флакон 30,О мл
Отмывочный раствор №1 - 1 пробирка, 20,0 мл
Концентрат для отмывочного раствора №2 - 1 пробирка, 20,0 мл
Суспензия сорбента - 2 пробирки по 2,0 мл
Буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5,0 мл
1.3. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:
Смесь праймеров "Сhlа" - 1 пробирка, 0,25 мл
Смесь праймеров "ВС-Л" - 1 пробирка, 0,25 мл
Смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,5 мл
5-кратный реакционный буфер - 1 пробирка, 1,0 мл
Деионизованная вода - 1 пробирка, 2,0 млФермент Таq-полимераза - 1 пробирка,
0,1мл
Положительная контрольная ДНК (ДНК С. рsittaci)- 1 пробирка, 0,2 мл
ДНК внутреннего стандарта (ДНК ВС-Л) - 1 пробирка, 1,0 мл
Воск для ПЦР - 2 пробирки по 1,0 мл
Масло минеральное - 1пробирка, 5,0 мл
1.4. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из
следующих компонентов:
Концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25,0 мл
Агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2,0 г
1.5.Тест-система должна быть упакована в картонную коробку с этикеткой,
на которой указаны: полное наименование тест-системы, перечень наборов, вхо-
дящих в него, наименование предприятия-изготовителя, номер серии, номер кон-
троля, дата изготовлениям срок годности, условия хранения и обозначения ТУ. В
каждую упаковку вкладывают наставление по применению тест-системы.
Внутрь коробки тест-системы вложены три запаянных полиэтиленовых паке-
та с вышеперечисленными наборами. На этикетке каждого из наборов должно быть
указано наименование набора, перечень компонентов, количество пробирок каждо-
го компонента, количество препарата в каждой пробирке, номер серии набора, да-
та изготовления, срок годности, условия хранения.
На пробирки с каждым компонентом должна быть нанесена этикетка с указа-
нием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке, номе-
ра серии и даты изготовления.
1.6.Тест-систему транспортируют и хранят при температуре 2-8 гр.С.
При получении и вскрытии коробки тест-системы исследователем можно
хранить набор для выделения ДНК и набор для электофоретического анализа про-
дуктов ПЦР - при температуре 2-25 гр.С в темном сухом месте, а набор для прове-
нии ПЦР - при температуре 2-8 гр.С.
1.7. Срок годности тест-системы - 6 мес. со дня изготовления.
2. Отбор материала для исследования.
2.1.При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для иссле-
дования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов
внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкция-
ми по данному вопросу.
2.2.Для исследования используют:
-соскобы слизистых оболочек (конъюктивы, урогеитального тракта, а у птиц -
клоаки), помет птиц;
- паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки пло-
довых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг
аборт-плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производите-
лей, подозрительных по заболеванию.
2.3.Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 мл, из тканей и орга-
нов вырезают кусочки размером 3 х 3 х 3 см (при невозможности толщина кусочков
может быть меньше).
2.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий
день, сохраняя при 4°С. Допускается хранение материала при минус 20°С в тече-
ние 1 мес. Пробы мочи нужно доставлять а тот же день.
3. Подготовка исследуемого материала
3.1.Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипе-
точными дозаторами переменных объемов (типа "Ленпипет") с использованием од-
норазовых полипропиленовых пробирок на 1,5 мл и 10,0 мл (ПО "Ленполимер") и
наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда
(пробирки, наконечники) после применения должна сбрасываться в специальный
контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или
5%-ный раствор хлорамина Б. После 3-часовой выдержки раствор выливают в ка-
нализацию, а отработанный пластик выбрасывают в мусорный контейнер.
3.2. Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 мл (при необходимости
объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора)
и центрифугируют при 3*10 куб. об/мин в течение 10-15 мин. Супернатант осторожно
сливают, оставив над осадком примерно 0,5 мл жидкости. Осадок ресуспензируют в
оставшейся надосадочной жидкости, переносят в пробирку типа "эппендорф" и
осаждают на микроцентрифуге при (11-12)*10 куб.об/мин в течение 8-10 мин.
Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и
используют для выделения ДНК.
3.3.Пробы органов, плодовых оболочек, размером З х З х З мм помещают в
пробирки типа "эппендорф" тщательно растирают отдельными стеклянными па-
лочками, добавляют по 1 мл физиологического раствора и тщательно перемеши-
вают. Смесь отстаивают при температуре 20-25°С в течение 30 мин, после чего
верхнюю фазу переносят в другие пробирки типа "эппендорф" и центрифугируют при
(11-12)*10куб.об/мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают,
осадок ресуспецдируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для
выделения ДНК.
3.4. Сперму в объеме 0,5 мл разводят равным объемом физиологического
раствора, осаждают на микроцентрифуге при 5*10куб. об/мин в течение 3-5 мин,
надосадочную жидкость используют для выделения ДНК.
3.5.Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 мл физиологического рас-
твора, осаждают на микроцентрифуге при (11-12)*10 куб.об/мин в течение 8-10 мин.
Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 100 мкл физио-
логического раствора и используют для выделения ДНК. Если слизь очень густая
(не всасывается в отверстие наконечника пипетки), то к пробе добавляют 1-2 мл
раствора меркаптоэтанола (0,1М), разменивают на вортексе, оставляют на рабо-
чем столе на 3-5 мин, а затем центрифугируют в вышеуказанном режиме. Осадок
ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделе-
ния ДНК.
3.6.Пробы помета птиц 0,1-0,2 г вносят в пробирку с 0,5 мл физиологического
раствора, перемешивают и осаждают на микроцентрифуге при 2*10 куб.об/мин, в
течение 1 мин. Из надосадочной жидкости выделяют ДНК.
4.Проведение ПЦР-анализа
4.1.ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах),
для работы в которых требуются следующие материалы и оборудование:
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1
- 100 мл спирта этилового ректификованного по ГОСТ 5962-67;
- настольный бокс с бактерицидной лампой "Циклотемп" (СП "РТС");
- термостат для пробирок типа "эппендорф на 25-100 гр.С ( фирма"Биоком");
- микроцентрифуга до (12-16)*10куб.об/мин ("Еlmi", "Неttish");
- центрифуга/вортекс"Мiсrо-spin", "Мinigen" ("Биоком);
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема ("Биоком");
- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером ("Биоком" "Хеликон");
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 мл типа "эппендорф" ("Хеликон");
- штативы для пробирок, наконечников ("Хеликон");
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- холодильник на 2-8 гр.С с морозильной камерой на минус 20°С.
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2.
- амплификатор ("ДНК-технология", "Реrkin elmer");
- ПЦР-бокс "Циклотемп" (СП"РТС") или отдельный стол с УФ-лампой;
- отдельный халат и одноразовые перчатки;
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема ("Биоком");
- одноразовые наконечники в штативах ("Биоком");
- одноразовые микропробирки для ПЦР на О,5 мл ("Хеликон");
- штативы для микропробирок на 0,5 мл ("Хеликон");
- холодильник на 2-8 гр.С, морозильник на минус 20°С для выделенных ДНК;
- термостат для микропробирок с воском на 95°С ("Биоком").
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3.
- камера для горизонтального электрофореза ("Хеликон", "ДНК-технология") на 50
проб;
- источник постоянного тока с напряжением 150-200 В ("ДНК-технология");
- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей ("Биоком");
- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка "Микрат-ЗОО";
- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
- аквадистиллятор;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;
- мерный цилиндр на 1л;
- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
4.2.Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала
Работа проводится в зоне 1. Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного материала
проводят с помощью набора №1. Предварительно готовят отмывочный раствор №2,
смешав в отдельном флаконе 20 мл концентрата из набора, 80 мл дистиллированной
воды и 100 мл 96%-нога этилового спирта. Смесь хорошо перемешивают и хранят при
температуре 20-22°С под плотно закрытой крышкой. Проверяют состоящие сорбента -
при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии.
В ряд полипропиленовых пробирок вместимостью 1,5 мл вносят по 1ОО мкл
предварительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контроль-
ных проб 1-го этапа анализа ("контролей выделения"): отрицательные пробы
элюирующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае подго-
товки пробы с его использованием), положительная проба - ДНК С.ресоrum (из
набора №2), разведенная 1:10 элюирующим буфером ( 90 мкл + 10 мкл).
Вносят по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным
наконечником с аэрозольным барьером)и тщательно пипетируют 5-10 раз до пол-
ного лизиса пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор.
В лизированный материал добавляют 10 мкл ДНК ВС-Л. Прогревают про-
бирку в термостате при 65гр. С 5 мин, тщательно перемешивают на вортексе до
полного растворения материала.
Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую
пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают содержимое пробирки
на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбентам еще раз пе-
ремешивают и отстаивают 5-7мин.
Осаждают сорбент на вортексе-центрифуге в течение 30 с и удаляют супер-
натант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать ваку-
умный отсос с колбой-ловушкой для удаляемой жидкости).
Вносят по 200 мкл отмывочного раствора №1 , перемешивают на вортексе до
полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его разбива-
ют при помощи наконечника пипетки), осаждают на вортексе-центрифуге в течение
30 с и удаляют супернатант в колбу-ловушку.
Вносят по 800 мкл отмывочного раствора №2, перемешивают на вортексе до
полного ресуспендировання сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10*10куб.
об/мин в течение 30 с и удаляют супернатант в колбу-ловушку.
Повторяют процедуру отмывки раствором №2, тщательно удаляют суперна-
тант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в термостате
при 65 гр.С в течение 5-7 мин.
Вносят по 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в тер-
мостат при 65 гр.С на 5 мин, встряхивая на вортексе через каждую минуту.
Осаживают на микроцентрифуге при 10*10куб. об/мин в течение 1 мин.
Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.
ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).
Пробирку с воском ставят в термостат при 95 гр.С
до полного расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя сте-
рильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при 120° С в
течение 15 мин):
- для амплификации ДНК Сhamydia: к 0,25 мл праймеров "Сhla" добавляют 0,25
мл нуклеотидов, смешивают на вортексе;
- для амплификации ДНК ВС-Л: к 0,25 мл праймеров "ВС-Л" добавляют 0,25 мл
нуклеотидов) смешивают на вортексе.
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают
сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость,
закрывают крышки, нз верхней части которых наносят пометки "Сhia" или "ВС-Л".
Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают пробирки в
эмплификаторе 5 мин при 95гр.С и охлаждают. В таком виде пробирки хранятся в
морозильнике несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.
Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 мл 5-кратного реакционного буфера добавляют
0,45 мл деионизованной воды и 0,05 мл Таq-полимеразы, хорошо перемешивают на
вортексе. Смесь хранится при 2-8°С в течение месяца (не замораживать!).
Ставят два ряда пробирок с "нижними" смесями ("Сhla" и "ВС-Л") в штатив по
числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли
выделения" ), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода, ДНК
С. рsittaci и ДНК ВС-Л, разведенные деионизованнои водой 1:10), нумеруют их в
нижней части крышки.
Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, при
этом она не должна протекать под воск и смешиваться с "нижней" смесью. В против-
ном случае пробирку считают браком и выбрасывают.
Сверху раскапывают по 1 капле минерального масла.
Под масло вносят по 10 мкл проб - испытуемых и контрольных двух этапов ана-
лиза (для каждой пробы две пробирки - из ряда "Сh1а" и ряда "ВС-Л").
Набирают на амплификаторе нужную программу:
- для Сlamydia рsittaci
Амплификаторы с регулированием
температуры по матрице (скорость
нагрева-охлаждения-не менее 1 гр.С/сек
"Ампли-3" (Биоком)
"Мinicycler", "РТС-100" (mj research)
|
Амплификаторы с активным регулированием
(по раствору в пробирке)
"gene amp psr system 2400" (perkin elmer)
"omn-e" (hibaid)
"Терцик" (ДНК-технология)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-1 мин.,
62 гр.С-1 мин.,
72 гр.С-1 мин. 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-10 с,
62 гр.С-10 с,
72 гр.С-10 с 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
Для ВС-Л
Амплификаторы с регулированием
температуры по матрице (скорость
нагрева-охлаждения-не менее 1 гр.С/сек
"Ампли-3" (Биоком)
"Мinicycler", "РТС-100" (mj research)
|
Амплификаторы с активным регулированием
(по раствору в пробирке)
"gene amp psr system 2400" (perkin elmer)
"omn-e" (hibaid)
"Терцик" (ДНК-технология)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-1 мин.,
62 гр.С-1 мин.,
72 гр.С-1 мин. 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-10 с,
62 гр.С-10 с,
72 гр.С-10 с 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
Через 1-2 мин после запуска программы, когда температура в ячейке амплифи-
катора достигнет 95°С. ставят программу на паузу, помещают пробирки в ячейки,
закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут окончания реакции (примерно 2,5
часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице и 1ч 40с на ампли-
фикагоре с активным регулированием).
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:
-chlamidia psittaci - 1033п.н.
-ВС-Л - 500п.н.
После окончания реакции (в тот же день или после хранения утром следующего
дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату для анализа
продуктов ПЦР (зону 3), который проводится разделением фрагментов ДНК в агароз-
ном геле.
ЭТАП 3. электрофоретический анализ продуктов ПЦР
Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной
комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим мани-
пуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических
лабораториях, использующие метод полимеразной цепной реакции. Основные по-
ложения.", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 27.01.1997г.
№ 13-7-2/840.).
В мерный цилиндр наливают 25 мл концентрированного буфера, доводят
дистиллированной водой до 500 мл, закрывают цилиндр парафинированной плен-
кой ("parafilm") и перемешивают.
Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из тер-
мостойкого стекла объемом 250 мл, наливают 100 мл готового буфера и плавят на
кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого кипятят агаро-
зу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу.
Заливают агарозный гель в форму по размеру используемой камеры
(толщина 5-6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга.
После полного застывания геля (примерно 30 мин ) осторожно вынимают гребенки,
не повредив лунки, разрезают на полосы 3-3,5 см.
Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лун-
ки были обращены в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок должна
двигаться к положительному электроду). Наливают буфера столько, чтобы он по-
крыл гель на 4-5 мм.
Ставят пробирки с продуктами амплификации в штатив в два ряда (на осно-
ве праймеров "Сhla" и "ВС-Л"). Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и
вносят на дно лунки (например, амплификат пробы №6 из ряда "Сhla" вносят в од-
ну полосу геля, затем амплификат той же пробы из ряда "ВС-Л" - в другую полосу).
Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пилотируя 1-2 раза) бу-
фером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет нару-
шения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пу-
зырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента,
как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля.
Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, располо-
жив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под
другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультра-
фиолетовым излучением.(Глаза и лицо должны быть защищены специальной мас-
кой или стеклянной пластиной).
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в прохо-
дящем ультрафиолете на поляроидную пленку или "Микрат 300" Документирова-
ние результатов можно проводить с помощью других систем: insta dос i, insta Оос
ii ( фотографирующие). gel dос 1000, или Шатер ДВ (компьютерные).
5.Учет и интерпретация результатов
5.1.Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов амплифи-
кации ДНК внутреннего стандарта. Все амплификаты "ВС-Л" (кроме "контролей ПЦР"-
ДНК С.psittaci и деионизованная вода) должны содержать полосу 500п.н. Если в
дорожке какой-либо исследуемой пробы полоса ВС-Л отсутствует, то отрицательный
результат анализа данной пробы на ДНК chlamydia psittaci учитывать нельзя.
Положительные пробы должны содержать специфическую светящуюся полосу
большей или меньшей интенсивности строго на том же уровне, что и полоса с
положительным контрольным образцом ДНК С. psittaci. В ярко положительных пробах
может отсутствовать полоса ВС-Л и результат учитывают как положительный при
условии правильного учета результатов анализа "контролей" см. таблицы №1 и №2.
Отрицательными считаются пробы, которые содержат только полосу ВС-Л.
Кроме полос 1036 п.н. и 500 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие раз-
мытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п.( в ниж-
ней части дорожки).
Таблица №1
Интерпретация результатов анализа
Результат
ПЦР-анализа
|
результат амплификации исследуемой пробы
|
.
|
с праймерами на
ДНК ВС-Л
|
с праймерами на
ДНК С.psittsci
|
положительный
|
+
|
+
|
положительный
|
-
|
+
|
отрицательный
|
+
|
-
|
недействительный
|
-
|
-
|
Таблица №2
Учет результатов амплификации контрольных образцов.
.
|
Название реагента
|
с праймерами
"ВС-Л"
|
с праймерами
"chla"
|
"контроли"
1-го этапа
|
физиологический раствор
|
+
|
-
|
.
|
элюирующий буфер
|
+
|
-
|
.
|
ДНК С.psittaci 1:10
|
+
|
-
|
"контроли"
2-го этапа
|
ДНК С.psittaci 1:10
|
-
|
+
|
.
|
ДНК ВС-Л 1:10
|
+
|
-
|
.
|
деинизированная вода
|
-
|
-
|
Если результаты анализа контрольных образцов не совпадают с приведенными
в таблице №2, то анализ считают недействительным и исследование повторяют.
При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует
большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля
появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до само-
го низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в по-
ложительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце
полоса отсутствует.
5.2. Результаты анализа не учитываются, если:
В дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повто-
рить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на
первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очист-
ке от ингибиторов.
В дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая по-
лоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК
или продуктами амплификации положительной ДНК (1 и 2 этапы). Для проверки
реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе
выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для выявления источника
контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы.
В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Воз-
можные причины: неправильное проведение "горячего старта" или неверный тем-
пературный режим в ячейках амплификатора.
6. Предъявление рекламаций
В случае несоответствия препарата указанным в настоящем наставлении
требованиям, использование тест-системы прекращают и данную серию препарата
направляют с нарочным (или пересылают) во Всероссийский Государственный
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ве-
теринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) и в Централь-
ную научно-методическую ветеринарную лабораторию (111622, Москва, Оранже-
рейная ул., 23) в соответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России "О порядке
предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и заку-
паемые по импорту" № 227/28 от 8 мая 1992 года. Второй экземпляр сопроводи-
тельного письма направляют на предприятие-изготовитель.
Наставление разработано Всероссийским Государственным научно-иссле-
довательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных
препаратов, Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии.
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 17.12.98 г., прото-
кол №5, № ПВР 1.05.0867-98
Начальник отдела ветеринарно-
санитарной экспертизы и лабо-
раторной диагностики В.И.Белоусов