Наставление
по применению тест-системы
«ХЛА-ПЕК» для выявления возбудителя
хламидиоза Сhlamydia pecorum
методом полимеразной цепной реакции
1. Общие положения
2. Отбор материала для исследования
3. Подготовка исследуемого материала
4. Проведение ПЦР-анализа
5. Учет и интерпретация результатов
6. Предъявление рекламаций
Таблица №1
Интерпретация результатов анализа
Таблица №2
Учет результатов амплификации контрольных образцов
.
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/1577 от 26 апреля 1999 г. В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы
«ХЛА-ПЕК» для выявления возбуди-
теля хламидиоза Сhlamydia pecorum
методом полимеразной цепной реак-
ции
1. Общие положения.
1.1. Тест-система предназначена для выявления ДНК Сhlamydia pecorum ме-
тодом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в биологическом материале от сель-
скохозяйственных животных. В основе метода лежит многократное повторение
циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 95°С, отжига спе-
цифических олигонуклеотидных затравок (праймеров) при температуре 62 гр.С и син-
теза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента при температуре 72°С.
В данной тест-системе используется неконкурентный внутренний стандарт
(фрагмент ДНК фага лямда, позволяющий контролировать эффективность протекания
всего процесса для каждой исследуемой пробы.
В состав тест-системы, рассчитанной на проведение 100 анализов, входят:
- набор для выделения ДНК (набор №1 )
- набор для проведения ПЦР (набор № 2)
- набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР(набор № 3)
1.2. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
Лизирующий раствор - 1 флакон 30,О мл
Отмывочный раствор №1 - 1 пробирка, 20,0 мл
Концентрат для отмывочного раствора №2 - 1 пробирка, 20,0 мл
Суспензия сорбента - 2 пробирки по 2,0 мл
Буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5,0 мл
1.3. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:
Смесь праймеров "Сhlа" - 1 пробирка, 0,25 мл
Смесь праймеров "ВС-Л" - 1 пробирка, 0,25 мл
Смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,5 мл
5-кратный реакционный буфер - 1 пробирка, 1,0 мл
Деионизованная вода - 1 пробирка, 2,0 мл
Фермент Таq-полимераза 1 пробирка, 0,1мл
Положительная контрольная ДНК (ДНК С. ресоrum) - 1 пробирка, 0,2 мл
ДНК внутреннего стандарта (ДНК ВС-Л) - 1 пробирка, 1,0 мл
Воск для ПЦР - 2 пробирки по 1,0 мл
Масло минеральное - 1пробирка, 5,0 мл
1.4. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из
следующих компонентов:
Концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25,0 мл
Агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2,0 г
1.5.Тест-система должна быть упакована в картонную коробку с этикеткой,
на которой указаны: полное наименование тест-системы, перечень наборов, вхо-
дящих в него, наименование предприятия-изготовителя, номер серии, номер кон-
троля, дата изготовлениям срок годности, условия хранения и обозначения ТУ. В
каждую упаковку вкладывают наставление по применению тест-системы.
Внутрь коробки тест-системы вложены три запаянных полиэтиленовых паке-
та с вышеперечисленными наборами. На этикетке каждого из наборов должно быть
указано наименование набора, перечень компонентов, количество пробирок каждо-
го компонента, количество препарата в каждой пробирке, номер серии набора, да-
та изготовления, срок годности, условия хранения.
На пробирки с каждым компонентом должна быть нанесена этикетка с указа-
нием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке, номе-
ра серии и даты изготовления.
1.6.Тест-систему транспортируют и хранят при температуре 2-8 гр.С.
При получении и вскрытии коробки тест-системы исследователем можно
хранить набор для выделения ДНК и набор для электофоретического анализа про-
дуктов ПЦР - при температуре 2-25 гр.С в темном сухом месте, а набор для прове-
нии ПЦР - при температуре 2-8 гр.С.
1.7. Срок годности тест-системы - 6 мес. со дня изготовления.
2. Отбор материала для исследования
2.1.При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для иссле-
дования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов
внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкция-
ми по данному вопросу.
2.2.Для исследования используют:
- паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки пло-
довых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг
аборт-плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производите-
лей, подозрительных по заболеванию, соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы,
урогенитального тракта).
2.3.Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 мл, из тканей и орга-
нов вырезают кусочки размером 3 х 3 х 3 см (при невозможности толщина кусочков
может быть меньше).
2.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий
день, сохраняя при 4°С. Допускается хранение материала при минус 20°С в тече-
ние 1 мес. Пробы мочи доставляют а тот же день.
3. Подготовка исследуемого материала
3.1.Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипе-
точными дозаторами переменных объемов (типа "Ленпипет") с использованием од-
норазовых полипропиленовых пробирок на 1,5 мл и 10,0 мл (ПО "Ленполимер") и
наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда
(пробирки, наконечники) после применения должна сбрасываться в специальный
контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или
5%-ный раствор хлорамина Б. После 3-часовой выдержки раствор выливают в ка-
нализацию, а отработанный пластик выбрасывают в мусорный контейнер.
3.2. Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 мл (при необходимости
объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора)
и центрифугируют при 3*10 куб. об/мин в течение 10-15 мин. Супернатант осторожно
сливают, оставив над осадком примерно 0,5 мл жидкости. Если осадок практически
не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 мл материала и повторяют центри-
центрифугирование. Осадок суспендируют в оставшейся надосадочной жидкости,
переносят в пробирку типа "эппендорф" и осаждают на микроцентрифуге при
11*10 куб.об/мин в течение 8-10 мин. Супернатант отбрасывают, осадок ресуспенди-
руют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК.
3.3.Пробы органов, плодовых оболочек, размером З х З х З мм помещают в
пробирки типа "эппендорф" тщательно растирают отдельными стеклянными па-
лочками, добавляют по 1 мл физиологического раствора и тщательно перемеши-
вают. Смесь отстаивают при температуре 20-25°С в течение 30 мин, после чего
верхнюю фазу переносят в другие пробирки и центрифугируют при (11-12)*10куб.
об/мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресус-
пецдируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения
ДНК.
3.4. Сперму в объеме 0,5 мл разводят равным объемом физиологического
раствора, осаждают на микроцентрифуге при 5*10куб. об/мин в течение 3-5 мин,
надосадочную жидкость используют для выделения ДНК.
3.5.Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 мл физиологического рас-
твора, осаждают на микроцентрифуге при (11-12)*10 куб.об/мин в течение 3-5 мин.
Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 100 мкл физио-
логического раствора и используют для выделения ДНК. Если слизь очень густая
(не всасывается в отверстие наконечника пипетки), то к пробе добавляют 1-2 мл
раствора меркаптоэтанола (0,1М), разменивают на вортексе, оставляют на рабо-
чем столе на 3-5 мин, а затем центрифугируют в вышеуказанном режиме. Осадок
ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделе-
ния ДНК.
4.Проведение ПЦР-анализа
4.1. Наконечники после внесения исследуемых проб сбрасывают в дезинфи-
цирующий раствор (см.п.3.1.), а далее по ходу реакции (до конца 3 этапа)
утилизация пластиковой посуды не требует специальных мер безопасности
(выбрасывают в мусорный контейнер).
4.2.ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах),
для работы в которых требуются следующие материалы и оборудование:
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1
- 100 мл спирта этилового ректификованного по ГОСТ 5962-67;
- настольный бокс с бактерицидной лампой "Циклотемп" (СП "РТС");
- термостат для пробирок типа "эппендорф на 25-100 гр.С ( фирма"Биоком");
- микроцентрифуга до (12-16)*10куб.об/мин ("Еlmi", "Неttish");
- центрифуга/вортекс"Мiсrо-spin", "Мinigen" ("Биоком);
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема ("Биоком");
- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером ("Биоком" "Хеликон");
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 мл типа "эппендорф" ("Хеликон");
- штативы для пробирок, наконечников ("Хеликон");
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- холодильник на 2-8 гр.С с морозильной камерой на минус 20°С.
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2.
- амплификатор ("ДНК-технология", "Реrkin elmer");
- ЛИР-бокс "Циклотемп" (СП"РТС") или отдельный стол с УФ-лампой;
- отдельный халат и одноразовые перчатки;
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема ("Биоком");
- одноразовые наконечники в штативах ("Биоком");
- одноразовые микропробирки для ПЦР на О,5 мл ("Хеликон");
- штативы для микропробирок на 0,5 мл ("Хеликон");
- холодильник на 2-8 гр.С, морозильник на минус 20°С для выделенных ДНК;
- термостат для микропробирок с воском на 95°С ("Биоком").
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3.
- камера для горизонтального электрофореза ("Хеликон", "ДНК-технология") на 50
проб;
- источник постоянного тока с напряжением 150-200 В ("ДНК-технология");
- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей ("Биоком");
- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка "Микрат-ЗОО";
- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
- аквадистиллятор;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;
- мерный цилиндр на 1л;
- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
4.3.Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала
Работа проводится в зоне 1. Выделение ДНК проводят с помощью набора
№1. Предварительно готовят отмывочный раствор №2, смешав в отдельном фла-
коне 20 мл концентрата из набора, 80 мл дистиллированной воды и 100 мл 96%-
нога этилового спирта. Смесь хорошо перемешивают и хранят при температуре
20-22°С под плотно закрытой крышкой. Проверяют состоящие сорбента - при от-
стаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии. После
этого приступают к выделению ДНК.
В ряд полипропиленовых пробирок вместимостью 1,5 мл вносят по 1ОО мкл
предварительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контроль-
ных проб 1-го этапа анализа ("контролей выделения"): отрицательные пробы
элюирующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае подго-
товки пробы с его использованием), положительная проба - ДНК С.ресоrum (из
набора №2), разведенная 1:10 элюирующим буфером ( 90 мкл + 10 мкл).
Добавляют по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным
наконечником с аэрозольным барьером)и тщательно пипетируют 5-10 раз до пол-
ного лизиса пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор.
В лизированный материал добавляют 10 мкл ДНК ВС-Л. Прогревают про-
бирку в термостате при 65гр. С 5 мин, тщательно перемешивают на вортексе до
полного растворения материала.
Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую
пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают содержимое пробирки
на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбентам еще раз пе-
ремешивают и отстаивают 5-7мин.
Осаждают сорбент на вортексе-центрифуге в течение 30 с и удаляют супер-
натант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать ваку-
умный отсос с колбой-ловушкой для удаляемой жидкости).
Вносят по 200 мкл отмывочного раствора №1 , перемешивают на вортексе до
полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его разбива-
ют при помощи наконечника пипетки), осаждают на вортексе-центрифуге в течение
30 с и удаляют супернатант в колбу-ловушку.
Вносят по 800 мкл отмывочного раствора №2, перемешивают на вортексе до
полного ресуспендировання сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10*10куб.
об/мин в течение 30 с и удаляют супернатант в колбу-ловушку.
Повторяют процедуру отмывки раствором №2, тщательно удаляют суперна-
тант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в термостате
при 65 гр.С в течение 5-7 мин.
Вносят по 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в тер-
мостат при 65 гр.С на 5 мин, встряхивая на вортексе через каждую минуту.
Осаживают на микроцентрифуге при 10*10куб. об/мин в течение 1 мин.
Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.
ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).
Работа проводится в зоне 2. Пробирку с воском ставят в термостат при 95 гр.С
до полного расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя сте-
рильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при 120° С в
течение 15 мин):
- для амплификации ДНК С.реcorum: к 0,25 мл праймеров "Сhla" добавляют 0,25
мл нуклеотидов, смешивают на вортексе;
- для амплификации ДНК ВС-Л: к 0,25 мл праймеров "ВС-Л" добавляют 0,25 мл
нуклеотидов) смешивают на вортексе.
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают
сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость,
закрывают крышки, нз верхней части которых наносят пометки "Сhia" или "ВС-Л".
Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают пробирки в
эмплификаторе 5 мин при 95гр.С и охлаждают. В таком виде пробирки хранятся в
морозильнике несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.
Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 мл 5-кратного реакционного буфера добавляют
0,45 мл деионизованной воды и 0,05 мл Таq-полимеразы, хорошо перемешивают на
вортексе. Смесь хранится при 2-8°С в течение месяца (не замораживать!).
Ставят два ряда пробирок с "нижними" смесями ("Сhia" и "ВС-Л") в штатив по
числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли
выделения" ), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода, ДНК
С. ресоrum, ДНК ВС-Л, разведенные деионизованнои водой 1:10), нумеруют их в
нижней части крышки.
Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, при
этом она не должна протекать под воск и смешиваться с "нижней" смесью. В против-
ном случае пробирку считают браком и выбрасывают.
Сверху раскапывают по 1 капле минерального масла.
Под масло вносят по 10 мкл проб - испытуемых и контрольных двух этапов ана-
лиза (для каждой пробы две пробирки - из ряда "Сh1а" и ряда "ВС-Л").
Набирают на амплификаторе нужную программу:
- для С.pecorum
Амплификаторы с регулированием
температуры по матрице (скорость
нагрева-охлаждения-не менее 1 гр.С/сек
"Ампли-3" (Биоком)
"Мinicycler", "РТС-100" (mj research)
|
Амплификаторы с активным регулированием
(по раствору в пробирке)
"gene amp psr system 2400" (perkin elmer)
"omn-e" (hibaid)
"Терцик" (ДНК-технология)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-1 мин.,
62 гр.С-1 мин.,
72 гр.С-1 мин. 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-10 с,
62 гр.С-10 с,
72 гр.С-10 с 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
-для ВС-Л
Амплификаторы с регулированием
температуры по матрице (скорость
нагрева-охлаждения-не менее 1 гр.С/сек
"Ампли-3" (Биоком)
"Мinicycler", "РТС-100" (mj research)
|
Амплификаторы с активным регулированием
(по раствору в пробирке)
"gene amp psr system 2400" (perkin elmer)
"omn-e" (hibaid)
"Терцик" (ДНК-технология)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-1 мин.,
65 гр.С-1 мин.,
72 гр.С-1 мин. 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
95 гр.С-2 мин. 1 цикл
95 гр.С-10 с,
65 гр.С-10 с,
72 гр.С-10 с 40 циклов
10 гр.С-12-14 час.(хранение)
|
Через 1-2 мин после запуска программы, когда температура в ячейке амплифи-
катора достигнет 95°С. ставят программу на паузу, помещают пробирки в ячейки,
закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут окончания реакции (примерно 2,5
часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице и 1ч 40с на ампли-
фикагоре с активным регулированием).
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:
-chlamidia percorun - 1036п.н.
-ВС-Л - 500п.н.
После окончания реакции (в тот же день или после хранения утром следующего
дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату для анализа
продуктов ПЦР (зону 3), который проводится разделением фрагментов ДНК в агароз-
ном геле.
ЭТАП 3. электрофоретический анализ продуктов ПЦР
Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной
комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим мани-
пуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических
лабораториях, использующие метод полимеразной цепной реакции. Основные по-
ложения.", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 27.01.1997г.
№ 13-7-2/840.).
В мерный цилиндр наливают 25 мл концентрированного буфера, доводят
дистиллированной водой до 500 мл, закрывают цилиндр парафинированной плен-
кой ("parafilm") и перемешивают.
Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из тер-
мостойкого стекла объемом 250 мл, наливают 100 мл готового буфера и плавят на
кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого кипятят агаро-
зу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу.
Заливают агарозный гель в форму по размеру используемой камеры
(толщина 5-6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга.
После полного застывания геля (примерно 30 мин ) осторожно вынимают гребенки,
не повредив лунки, разрезают на полосы 3-3,5 см.
Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лун-
ки были обращены в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок должна
двигаться к положительному электроду). Наливают буфера столько, чтобы он по-
крыл гель на 4-5 мм.
Ставят пробирки с продуктами амплификации в штатив в два ряда (на осно-
ве праймеров "Сhla" и "ВС-Л"). Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и
вносят на дно лунки (например, амплификат пробы №6 из ряда "Сhla" вносят в од-
ну полосу геля, затем амплификат той же пробы из ряда "ВС-Л" - в другую полосу).
Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пилотируя 1-2 раза) бу-
фером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет нару-
шения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пу-
зырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента,
как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля.
Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, располо-
жив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под
другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультра-
фиолетовым излучением.(Глаза и лицо должны быть защищены специальной мас-
кой или стеклянной пластиной).
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в прохо-
дящем ультрафиолете на поляроидную пленку или "Микрат 300" Документирова-
ние результатов можно проводить с помощью других систем: insta dос i, insta Оос
ii ( фотографирующие). gel dос 1000, или Шатер ДВ (компьютерные).
5.Учет и интерпретация результатов
5.1.Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов амплифи-
кации ДНК внутреннего стандарта. Все амплификаты "ВС-Л" (за исключением
"контролей ПЦР"- ДНК С.ресоrum и деионизованная вода ) должны содержать полосу
500п.н. Если в дорожке какой-либо исследуемой пробы полоса внутреннего стандарта
отсутствует, то отрицательный результат анализа данной пробы на ДНК chlamydia
ресоrum учитывать нельзя.
Положительные пробы должны содержать специфическую светящуюся полосу
большей или меньшей интенсивности строго на том же уровне, что и полоса с
положительным контрольным образцом ДНК С.ресоrum. В ярко положительных пробах
может отсутствовать полоса ВС-Л и результат учитывают как положительный при
условии правильного учета результатов анализа "контролей" см. таблицы №1 и №2.
Отрицательными считаются пробы, которые содержат только полосу ВС-Л.
Кроме полос 1036 п.н. и 500 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие раз-
мытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п.( в ниж-
ней части дорожки).
Таблица №1
Интерпретация результатов анализа
Результат
ПЦР-анализа
|
результат амплификации исследуемой пробы
|
.
|
с праймерами на
ДНК ВС-Л
|
с праймерами на
ДНК С.pecorum
|
положительный
|
+
|
+
|
положительный
|
-
|
+
|
отрицательный
|
+
|
-
|
недействительный
|
-
|
-
|
Таблица №2
Учет результатов амплификации контрольных образцов..
|
Название реагента
|
с праймерами
"ВС-Л"
|
с праймерами
"chla"
|
"контроли"
1-го этапа
|
физиологический раствор
|
+
|
-
|
.
|
элюирующий буфер
|
+
|
-
|
.
|
ДНК С.pecorum 1:10
|
+
|
+
|
"контроли"
2-го этапа
|
ДНК С.pecorum 1:10
|
-
|
+
|
.
|
ДНК ВС-Л 1:10
|
+
|
-
|
.
|
деинизированная вода
|
-
|
-
|
Если результаты анализа контрольных образцов не совпадают с приведенными
в таблице №2, то анализ считают недействительным и исследование повторяют.
При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует
большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля
появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до само-
го низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в по-
ложительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце
полоса отсутствует.
5.2. Результаты анализа не учитываются, если:
В дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повто-
рить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на
первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очист-
ке от ингибиторов.
В дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая по-
лоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК
или продуктами амплификации положительной ДНК (1 и 2 этапы). Для проверки
реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе
выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для выявления источника
контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы.
В дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Воз-
можные причины: неправильное проведение "горячего старта" или неверный тем-
пературный режим в ячейках амплификатора.
6. Предъявление рекламаций
В случае несоответствия препарата указанным в настоящем наставлении
требованиям, использование тест-системы прекращают и данную серию препарата
направляют с нарочным (или пересылают) во Всероссийский Государственный
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ве-
теринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) и в Централь-
ную научно-методическую ветеринарную лабораторию (111622, Москва, Оранже-
рейная ул., 23) в соответствии с указанием ГУВ Минсельхоза России "О порядке
предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и заку-
паемые по импорту" № 227/28 от 8 мая 1992 года. Второй экземпляр сопроводи-
тельного письма направляют на предприятие-изготовитель.
Наставление разработано Всероссийским Государственным научно-иссле-
довательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных
препаратов, Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии.
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам 17.12.98 г., прото-
кол №5, № ПВР 1.05.0868-98
Начальник отдела ветеринарно-
санитарной экспертизы и лабо-
раторной диагностики В.И.Белоусов