Наставление
по применению наборов антигена
и контрольной сыворотки для серологической
диагностики алеутской болезни норок в реакции
иммуноэлектроосмофореза (диагностикума).
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
2. ПОСТАНОВКА РИЭОФ
3. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИИ
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/142 от 23 августа 1994 г. В.В.Селиверстов
Наставление
по применению наборов антигена
и контрольной сыворотки для серологической
диагностики алеутской болезни норок в реакции
иммуноэлектроосмофореза (диагностикума).
1. Общие положения
1.1. Набор для серологической диагностики алеутской болезни норок
в реакции иммуноэлектроосмофореза /РИЭОФ/ содержит:
- антиген, приготовленный из штамма "П-1" /тканевой/ или штамма
"ПК" /культуральный/ вируса алеутской болезни норок;
- контрольную позитивную сыворотку.
1.2. Антиген выпускают в герметически закрытых стерильных стеклянных
флаконах по 5; 10; 12,5; 25 куб.см, содержит в 1 куб.см 100 тест-доз для РИЭОФ,
представляет собой коричневую или синевато-бирюзовую прозрачную жидкость.
1.3. Контрольную позитивную сыворотку выпускают в стерильных ампулах
или флаконах по 1 куб.см /100 тест-доз/, представляет собой прозрачную или
слегка опалесцирующую бесцветную жидкость.
1.4. Антиген и контрольная позитивная сыворотка пригодны к приме-
нению в течение 12 месяцев со дня изготовления при условии хранения в
темном месте при температуре 3-7гр.С. Замораживание диагностикума не
допускается. Антиген и сыворотка, утратившие прозрачность, к применению
не пригодны.
1.5. По истечении указанного срока хранения неизрасходованный
диагностикум проверяют на местах путем определения титра антитела и
контрольной позитивной сыворотки аналогично методике, изложенной в
п.2.7. При титре не ниже 1:4 антиген разрешается использовать в течение
трех месяцев, после чего его необходимо снова проверить. При титре
ниже 1:4 использование антигена не допускается.
1.6. Позитивную контрольную сыворотку после истечения срока годности
проверяют на местах и при титре не менее 1:16 разрешается использовать
ее для РИЭОФ в течение трех месяцев, затем ее снова проверяют. При титре
менее 1:16 сыворотку бракуют. В необходимых случаях допускается полу-
чение позитивной контрольной сыворотки в хозяйствах от спонтанно больных
норок, давших положительную РИЭОФ с антигеном алеутской болезни норок.
1.7. Исследование крови норок на алеутскую болезнь посредством
РИЭОФ проводят ветспециалисты звероводческих хозяйств /после специаль-
ной подготовки/, ветврачи ветеринарных лабораторий и научно-исследова-
тельских учреждений. Исследования проводят в порядке, предусмотренном
действующей инструкцией по борьбе с алеутской болезнью норок.
1.8. Для постановки РИЭОФ используют прибор для электрофореза
"ПЭФ-3","ЭФ-2" или аналогичных марок, вакуумный насос с электродвигателем,
осветлитель "ОИ-19" или настольную лампу с металлическим или пластмассовым
абажуром, столик с уровнем для разлива расплавленного агара, прибор для
определения рН растворов /иономер "ЭФ-74" или аналогичный/, пробойник
диаметром 2,5 мм для изготовления лунок в агаровом геле, резиновую
трубку, стеклянные пластинки 8 х 15 см, направляющую пластинку из оргстекла
для пробойника, пипетки градуированные на 10-25 куб.см, капилляры стеклян-
ные для взятия крови у норок, мерные колбы на 100-1000 куб.см, кюветы
эмалированные, агар для электрофореза, бумагу фильтровальную, мединал
/барбитал натрия/, веронал /барбитал/, дистиллированную воду.
2. ПОСТАНОВКА РИЭОФ
2.1. Для РИЭОФ применяют мединал-вероналовый или другие буферные
растворы с рН 8,6 - 8,9, пригодные для электрофореза белков. Мединал-
вероналовый буфер готовят путем растворения 10,32 г мединала в 300 куб.см
дистиллированной воды и последующего добавления 1,84 г веронала.
Раствор помешивают и держат в водяной бане при 40гр.С до полного раство-
рения веронала. Затем раствор доводят дистиллированной водой до
объема 1 литр и измеряют рН. В том случае, если реакция приготовлен-
ного мединал-вероналового раствора получилась ниже 8,6 - следует доба-
вить мединал, а если выше - веронал. После добавления мединала или
веронала каждый раз определяют рН раствора, доводя его до нужной кон-
центрации. Буферный раствор при массовых исследованиях используют в
течение трех-четырех дней. При ухудшении линий преципитации в контроле
следует заменить раствор и проверить активность диагностикума в соот-
ветствии с п.1.5.
2.2. На чистую обезжиренную стеклянную пластинку размером
8 х 15 см наливают 30 куб.см 1%-ного горячего раствора агара, разве-
денном пополам дистиллированной водой. После застывания в агаровом
геле делают лунки при помощи пробойника, соединенного трубкой с ваку-
умным насосом. Всего на агаровой пластинке делают 206 лунок с таким
расчетом, чтобы получилось десять полных горизонтальных рядов по
20 лунок в каждом и одиннадцатый нижний неполный /для контроля/ с
шестью лунками, размещенными парами слева, справа и в середине ряда.
Диаметр лунок должен быть 2,5 мм, глубина - 2,5 мм, фактический объем
около 0,01 куб.см, расстояние между центрами соседних лунок каждого гори-
зонтального ряда - 6 мм. Края агаровой пластинки на расстоянии не
менее 1 см не должны иметь лунок.
Для более точного расположения лунок используют заранее размечен-
ную миллиметровую бумагу, которую кладут под стеклянную пластинку,
или накладывают направляющую пластинку из оргстекла с просверленными
для пробойника отверстиями.
При единичных исследованиях можно использовать предметные стекла
или стеклянные пластинки меньшего размера.
После разлива агара пластинки должны быть использованы не позднее
двух часов при хранении во влажной камере /камера для электрофореза,
эксикатор и т.д./.
2.3. Кровь для исследования у норок берут в стеклянные капилляры,
которые с одного конца закрывают пластилином и центрифугируют при 1500-
3000 об/мин в течение 5 минут. Затем отламывают часть капилляра с сыво-
роткой и, не допуская ее разбрызгивания, осторожно выдувают при помощи
специальной груши или резиновой трубки в очередную лунку четного верти-
кального ряда. При необходимости можно использовать цельную кровь,
осадок эритроцитов, гемолизированную или хилезную сыворотку. Для конт-
роля реакции в четные лунки 11 горизонтального неполного ряда вносят
положительную контрольную сыворотку. Антиген закапывают пастеровской
пипеткой во все лунки нечетных вертикальных рядов /включая и контрольные/
и помещают пластинку в камеру электрофореза с тем расчетом, чтобы ток
проходил параллельно горизонтальным рядам. К краям пластинки прикреп-
ляют по 4-5 полосок фильтровальной бумаги и опускают их свободные концы
в ванны с буферным раствором, наполненные примерно на 2/3 объема.
Камеру закрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока так, чтобы
положительный полюс был справа /со стороны крайнего вертикального ряда
с сыворотками/. Сила тока должна быть 10-15 миллиампер на каждую стек-
лянную пластинку /0,08-0,12 ма/кв.см/, напряжение на выходе - 120-220 в.
Требуемые параметры тока /по показаниям приборов выпрямителя/ дости-
гаются путем изменения количества полосок фильтровальной бумаги, если
регулировка тумблерам не приводит к желаемому результату.
2.4. Предварительную читку реакции проводят через 15-45 минут
после размещения пластинки в силовом поле. Для этого отключают от сети
выпрямитель, открывают крышку камеры, вынимают пластинку и просматривают
ее в косопроходящем свете /осветитель ОИ-19 или другие источники света/
на темном фоне в затемненном помещении.
2.5. Положительная РИЭОФ характеризуется наличием тонкой четкой
прямой линии преципитации в горизонтальных рядах геля примерно на сере-
дине расстояния между лунками с сывороткой и антигеном. Расплывчатые
полосы в геле, диффузные или ограниченные изменения его прозрачности,
а также отсутствие изменений расценивается как отрицательный результат.
Окончательную читку реакции проводят после экспозиции стекла
с агаровой пластинкой в гипертоническом растворе /12,5%/ хлористого
натрия в течение 7-10 мин и последующего отмывания в дистиллированной
воде /6-18 ч/ для удаления неспецифических полос сывороточного белка.
При обнаружении едва различимой линии преципитации результат РИЭОФ
считается сомнительным. В этом случае реакцию ставят повторно с новой
прсбой сыворотки. Подтвержденный сомнительный результат РИЭОФ засчи-
тывают как положительный.
Показания РИЭОФ признают действительными, если на данной плас-
тинке в 11 горизонтальном ряду во всех трех контролях будет ясно вы-
ражена линия преципитации.
Положительный результат РИЭОФ указывает на заражение норок
алеутской болезнью и на необходимость изолированного их содержания
до момента убоя.
2.6. Результат исследования крови норок в хозяйствах записывают
в акте с указанием даты проведения исследований, количества и процента
реагирующих норок по отделениям и бригадам, наименования диагностикума,
номера его серии, контроля, предприятия-изготовителя, срока годности,
фамилии, имени и отчества ветработника, проводившего исследования.
Один экземпляр хранят в хозяйстве, второй направляют главному ветери-
нарному врачу района.
2.7. В необходимых случаях испытывают не только цельные сыворотки
и антиген, но и их последовательные разведения.
Для титрования антител у обследуемых норок берут кровь в пробирки
в объеме не менее 1-3 куб.см* и получают сыворотку общепринятым способом,
затем готовят последовательные двукратные разведения в физрастворе
от 1:2 до 1:262144 при помощи микротитратора "Такачи" или микропипеток.
Каждое разведение испытуемой сыворотки вносят в отдельную лунку
четных вертикальных рядов: в нечетные ряды закапывают неразведенный
стандартный антиген и пластинку помещают в камеру для электрофореза
на 15-45 мин. Одновременно ставят контроль положительной стандартной
сыворотки, начиная с разведения 1:2 до 1:64 со стандартным антигеном.
Учет реакции проводят в соответствии с п.2.5. За титр антител в испы-
туемой сыворотке принимают наибольшее ее разведение, в котором произош-
ла реакция при одновременном положительном результате с контрольной
позитивной сывороткой в предельном /1:64/ или половинном /1:32/ титре.
При титровании антигена готовят последовательные двукратные его
разведения от 1:2 до 1:4 в физрастворе. В лунки четных рядов вносят
неразведенную контрольную позитивную сыворотку, а в нечетные ряды -
антиген в последовательных разведениях. Пластинку помещают в камеру
для электрофореза и через 15-45 мин проводят учет реакции, как указано
в п.2.5.
2.8. По истечении срока годности диагностикума или при подозрении
на снижение его активности /слабая линия преципитации/ проводят титро-
вание антигена и сыворотки как указано в п.2.7. и в дальнейшем посту-
пают по п.п.1.5; 1.6.
3. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИИ
В случае проявления неспецифических реакций или слабой активности
диагностикума применение препаратов данной серии прекращают и об этом
сообщают Всероссийскому государственному научно-исследовательскому
институту контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препа-
ратов /123022, г.Москва, Звенигородское шоссе-5, ВГНКИ ветпрепаратов/
и предприятию-изготовителю набора. Сопроводительное письмо оформляют
в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Министерства
сельского хозяйства Российской Федерации от 8 мая 1992 г. №22-7/28
"0 порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного
производства и закупаемые по импорту".
При наличии невскрытых наборов с препаратами данной серии один
набор направляют в адрес института одновременно с рекламацией.
С утверждением настоящего Наставления утрачивает саду "Наставление
по применению набора антигена и контрольных сывороток в реакции иммуно-
олектроосмофореза для серологической диагностики алеутской болезни
норок, утвержденное Главветуапром МСХ СССР 04.07.80г.
Изменения от 30.09.96г. № 13-7-2/750