Наставление
по применению набора для
диагностики синдрома снижения яйценоскости-76 в реакции
задержки (торможения) гемагглютинации
1. Общие положения.
2. Порядок применения набора
3. Постановка реакции задержки (торможения) гемагглютинации
4. Учет и оценка результатов реакции.
5. Предъявление рекламаций.
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ Заместитель начальника
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России) В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
29.05.97г. № 13-7-2/970
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора для
диагностики синдрома снижения
яйценоскости-76 в реакции за-
держки (торможения) гемагглю-
тинации.
1. Общие положения.
1.1. Набор предназначен для выявления специфических анти-
тел (антигемагглютининов) к вирусу синдрома снижения яйценос-
кости-76 (ССЯ-76) в сыворотках крови кур и желтках яиц в реак-
ции задержки (торможения) гемагглютинации при оценке эпизооти-
ческой ситуации (ретроспективная диагностика) и для контроля
напряженности поствакцинального иммунитета у птицепоголовья,
привитого против указанной болезни.
1.2. В состав набора входят 3 компонента: инактивированный
антиген вируса ССЯ-76 - 3 ампулы; гипериммунная (контрольная
положительная) сыворотка крови кур к вирусу ССЯ-76 - 1 ампу-
ла; нормальная (контрольная отрицательная) сыворотка крови
кур - 1 ампула.
1.3. Все компоненты набора лиофилизированы и расфасованы
в ампулах в объеме до 1,0 куб.см в виде сухой пористой массы:
антиген - белого цвета со светло-желтым оттенком, сыворотки -
белого цвета с розовым оттенком. Активность препаратов указана
на этикетках ампул и должна бить не ниже 1 : 256 в реакции
гемагглютинации (РГА) для антигена и 1 :64 - в РЗГА для конт-
рольной положительной сыворотки. Отрицательная сыворотка крови
не должна содержать антитела к вирусу ССЯ-76.
1.4. Ампулы с диагностическими препаратами упакованы в ко-
робки. Каждая ампула должна иметь этикетку с указанием на ней
наименования биопрепарата, его объема в куб.см, номера серии, но-
мера контроля, титра биологической активности, даты изготовле-
ния и срока годности, а на коробке с компонентами набора должна
быть этикетка с указанием наименования набора, товарного знака
предприятия-изготовителя, полного названия набора и входящих в
него компонентов, номера серии и контроля, количества ампул каж-
дого препарата, его объема, титра биологической активности, даты
изготовления, условия хранения, срока годности и обозначения ТУ.
1.5. Срок годности набора - 18 мес. со дня изготовления при
условии хранения в сухом темном месте при температуре 4 - 3 гр.С.
Допускается хранение разведенных компонентов (сывороток - поло-
жительная и отрицательная) в морозильной камере бытового холо-
дильника до 30 дн., а разведенного антигена (рабочая доза 4 ГАЕ)
- до 48 ч. при температуре 4-8 гр.С.
1.6. Браковка.
При отсутствии этикетки, нарушении целостности
ампул, изменений цвета и консистенции содержимого,
наличии хлопьев и посторонних примесей при растворении, а также
при неполном растворении компоненты бракуют.
2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА
2.1. В ветеринарную лабораторию из птицеводческих хозяйств,
где отмечается снижение яичной продуктивности и снесение яиц
с депигментированной и размягченной скорлупой, доставляют по
20 - 25 проб сывороток крови от птиц разного возраста (100-120,
150 -180, 220 -250 дней) в объеме 0,3 - 0,5 куб.см каждая. Рекомен-
дуется проводить доставку парных проб сывороток крови, взятых от
одних и тех же птиц в начале заболевания и спустя 14-20 дней.
Первичные пробы сывороток крови хранят в морозильной камере бы-
тового холодильника и доставляют одновременно с повторно взятыми
сыворотками.
При подозрении на заболевание ССЯ-76 целесообразно достав-
лять некондиционные яйца (бесскорлупные, депигментированные
и др.) в количестве 20 - 30 штук с птичника.
Из желтков яиц готовят экстракты по следующей методике:
отбирают 1,5 куб.см желтка и суспендируют его в пробирке с 5,0 куб.см
физиологического раствора (рН 7,2-7,4). Затем в пробирки вносят
по 2,0 куб.см дихлорэтилена и 1,0 куб.см эфира для наркоэа, закрывают
резиновыми пробками, смесь интенсивно перемешивают на аппарате
для встряхивания 10-15 мин, а затем прогревают в течение 1 ч. при
37 гр.С, периодически встряхивая содержимое пробирок. После этого
пробирки помещают в цэнтрифугу и проводят цетрифугирование при
2000 об/мин в течение 15 мин. Полученная надосадочная жидкость
является экстрактом желтка в исходном разведении 1 : 5 и исполь-
зуется в качестве исследуемого материала.
Для определения напряженности поствакцинального иммунитета
в лабораторию доставляют сыворотки крови от вакцинированного
птицепоголовья сустя 3 - 4 недели после применения вакцины
против ССЯ-76.
2.2. Подготовка компонентов набора и постановка реакций
гемагглютинации (РГА).
2.2.1. Перед постановкой реакции набор с компонентами вы-
держивают 30 мин. при комнатной температуре (18 - 20гр.С). Затем
вскрывают ампулы с контрольными сыворотками крови и одну из
ампул с антигеном и вносят в каждую но 1,0 куб.см стерильного фи-
зиологического раствора рН 7,2-7,4. Ампулы осторожно встряхива-
ют в течение 1 - 3 мин. до полного растворения содержимого. Ис-
нользуемые в реакции физиологический раствор рН 7,2 - 7,4 и
1 %-ная взвесь эритроцитов готовят по общепринятым методикам.
2.2.2. Первоначально проводят определение активности (титр)
антигена, используя РГА при постановке ее макро- или микромето-
дом с применением плексигласовых планшетов.
Титром гемагглютинирующей активности вируса ССЯ-76 считает
предельное разведение его, при котором наблюдается полная агглю-
тинации эритроцитов, что соответствует одной гемагглютинирующей
единице (1 ГАЕ). С учетом полученных результатов готовят рабочее
разведение антигена, равное четырем гемагглютинирующим единицам
(4 ГАЕ). Например, если титр гемагглютинации равен 1 : 1024,то
рабочее разведение антигена будет 1024 : 4 = 256, т.е. в
0,2 (0,05)куб.см разведенного 1 : 256 антигена будет содержаться
4 ГАЕ. Для его приготовления необходимо взять 255 куб.см физиологи-
ческого раствора, добавить 1 куб.см исходного антигена и хорошо
перемешать.
2.2.3. Перед постановкой реакции задержки (торможения) ге-
магглютинации правильность выбранного рабочего разве-
дения антигена вируса.
Для этого в четыре лунки плексигласового планшета, начиная
(0,05) объем для микрометода со второй, вносят по 0,2 (0,05)
куб.см стерильного физиологического раствора, а затем в первую
и вторую лунки вносят до 0,2 (0,05) куб.см антигена в рабочем
разведении и готовят двукратные последовательные разведения,
начиная со второй лунки планшета. После этого в каждую лунку
вносят по 0,2 -0,05) куб.см 1%-ной взвеси эритроцитов кур,
осторожно встряхивают и ставят в термостат (37 гр.С) на 20 мин
или оставляют при комнатной температуре на 30 мин. При правильно
подобранном рабочем разведении антигена (4 ГАЕ) в первых трех
лунках, где соответственно содержатся 4,2 и 1 ГАЕ, должна наблю-
даться полная агглютинация эритроцитов (зонтик); в четвертой лун-
ке агглютинация может быть частичной или отсутствовать; в пятой
лунке агглютинации не должке быть, если в четвертой лунке оказы-
вается полная агглютинация, а в пятой - частичная или отсутствует-
- это означает, что выбранное рабочее разведение вируса содержит
не 4 ГАЕ, а больше. В этом случае количество антигена должно быть
соответственно уменьшено вдвое, т.е. следует взять 0,2 (0,05) куб.см
следующего разведения и повторно проверить рабочую дозу.
Особенно важно, чтобы в третьей лунке, где должна бить 1 ГАЕ
вируса, была бы полная агглютинация. Если в ней агглютинация
не полная, то выбранная рабочая доза разведения вируса содержит
меньше 4 ГАЕ в 0,2 (0,05) куб.см и должна быть увеличена и повторно
проверена. Реакция гемагглютинации является подготовительным
этапом в постановке реакции задержки (торможения) гемагглютинации
3. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ЗАДЕРЖКИ (ТОРМОЖИНИЯ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
3.1. Реакцию ставят в плексигласовых планшетах макро- или
микрометодом. При этом в каждую лунку планшета вносят по 0,2
(0,05) куб.см физраствора, затем в первые лунки каждого ряда вно-
cят во 0,2 (0,05) куб.см исследуемых сывороток крови или экстракта
желтка и с помощью пипетки проводят двукратные последовательные
разведения от 1:2 до 1:4096. После этого во все лунки вносят
по 0,2 (0,05)куб.см антигена в рабочем разведении. Планшет осторожно
встряхивают для равномерного перемешивания содержимого и ставят в термо-
стат (37 гр.С) на 20 мин. или оставляют при комнатной температуре
на 30 мин. для контакта антигена с антителами сыворотки. По истечении
указанного времени в каждую лунку планшета вносят по 0,4 (0,1) куб.см
1%-ной взвеси куриных эритроцитов, осторожно встряхивают и ставят в
термостат или оставляют при комнатной температуре.
3.2.2. Постановка реакции должна сопровождаться следующими
контролями:
-Положительная сыворотка-0,2(0,0,05)куб.см разведенной положительной
контрольной сыворотки + 0,2 (0,05)куб.см антигена в рабочем разведении
+0,4 (0,1)куб.см 1%-ной взвеси эритроцитов кур.
Наблюдается положительная реакция-отсутствие агглютинации эритроцитов,
Которые оседают на дне лунки в виде пуговки с ровными краями.
-Отрицательная сыворотка - 0,2(0,05)куб.см разведенной отрицательной
контрольной сыворотки + 0,2(0,05)куб.см антигена в рабочем разведении
+0,4(0,1)куб.см 1%-ной взвеси эритроцитов кур. Отрицательная реакция-
должна наблюдаться четко выраженная агглютинация эритроцитов, которые
оседают в лунках планшета в виде перевернутого зонтика.
-Контроль на самоагглютинацию эритроцитов-0,2(0,05)куб.см 1%-ной взвеси
эритроцитов (эритроциты должны оседать на дне лунки в виде пуговки без
признаков агглютинации).
-Контроль для исключения изсгемагглютинации -0,2(0,05)куб.см
исследуемых разведенных сывороток или яичного желтка +0,2(0,05)куб.см
физиологического раствора +0,4(0,1)куб.см 1%-ной взвеси эритроцитов
(агглютинации не должно быть).
3.3.Если в исследуемых пробах сывороток крови или экстрактах яичного
желтка содержатся специфические антитела (антигемаглютинины) к вирусу
ССЯ-76, то в лунках планшета агглютинации эритроцитов не должно быть-
реакцию задержки (торможения) гемагглютинации считают положительной.
Титром сыворотки или экстракта желтка считают предельное разведение
материала, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов. Титры
антител к вирусу ССЯ-76, как в сыворотках крови, так и в экстрактах
желтка яиц, практически одинаковы.
4.Учет и оценка результатов реакции.
4.1.Учет реакции следуют начинать с учета контролей. Только при
удовлетворительных результатах контрольной реакции можно учитывать
результаты основной реакции.
4.2.Обнаружение специфических антител (антигемагглютининов) в иссле-
дуемых пробах сывороток (желтках яиц) в титре 1:16 и выше у птице-
поголовья в хозяйствах, где не проводится специфическая профилактика
против ССЯ-76, является диагностическим и свидетельствует о циркуляции
полевого вируса ССЯ-76 и неблагополучии птицехозяйства по указанному
заболеванию.
4.3.Раститровка парных проб сывороток крови и выявление не менее 4-кратного
прироста антител у 50 и более процентов исследовательских проб дает основание
для постановки диагноза на ССЯ-76.
Если прирост титра антител в исследованных пробах материала не достиг
четырехкратного значения или выявлен менее чем в 50 процентах случаев,
то хозяйство считается условно благополучным и в лабораторию направляют
удвоенное количество проб материала для повторного серологического ис-
следования.
4.4.Поствакцинальный иммунитет считают напряженными, если титр специфичес-
ких антител к вирусу ССЯ-76 1:32 и выше не менее чем 80-ти процентов
исследованных проб сывороток крови. Если результаты контроля
неудовлетворительные, то проводят повторные серологические исследования
через 10-14 дней.
5.Предъявление рекламаций.
5.1.В случае несоответствия компонентов набора требованиям по активности и
специфичности или получении неспецифичности реакции, применение его прекращают и
в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии от 08.05.92 года №
22-7/28 "О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного
производства и закупаемые по импорту" направляют рекламацию на предприятие-
изготовитель, Всероссийский Государственный научно- исследовательский институт
контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва,
Звенигородское шоссе,5) и Центральную научно-производственную лабораторию
(ЦНПВЛ, 111162, Москва, ул. Оранжерейная,23). При наличии невскрытых наборов
один набор упаковывают, опечатывают и направляют с нарочным или почтой во
ВГНКИ.
С утверждением настоящего Наставления утрачивает силу на территории Российской
Федерации "Наставлению по применению набора для диагностики ССЯ-76 в реакции
задержки гемагглютинации", утвержденное 3 января 1992 года.
Наставление по применению набора для диагностики синдрома
снижения яйценоскости-76 в реакции задержки (торможения) гемагглю-
тинации разработано во Всероссийском научно-исследовательском
ветеринарном институте птицеводства.
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам Департамента
ветеринарии Минсельхозпрода РФ. Протокол № 2 от 27.03.96 г.ПВР 1.02.0192-96 г.