МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ
(Минсельхозпрод России) Заместитель начальника
Департамента ветеринарии
В.А.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
18.03.97г. № 13-7-2/883
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению сыворотки
гемолитической для реак-
ции связывания комплемента
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Сыворотка гемолитическая (гемолизин) представляет собой
консервированную глицерином сыворотку крови кролика, иммунизиро-
ванного эритроцитами барана, и предназначена для применения в
качестве компонента реакции связывания комплемента (РСК).
По внешнему виду гемолизин - прозрачная, слегка опалесцирую-
щая жидкость желтовато-розового цвета без плесени, хлопьев, осадка
и посторонней примеси. Допускается образование на поверхности
сыворотки пристеночного кольца белого цвета.
Гемолитическая сыворотка расфасована в ампулы по 1 куб.см.
1.2. На ампулу наклеивают этикетку или несмываемой краской
по стеклу наносят: сокращенное наименование препарата ("гемолизин")
номер серии, количество препарата в куб.см, срок годности.
1.3. Ампулы с гемолизином по 10-20 шт. укладывают в картонные
коробки по ГОСТ 12301 с разделительными перегородками, обеспечиваю-
щими их сохранность. В каждую коробку с ампулами вкладывают настав-
ление по применению гемолизина.
На коробку с ампулами наклеивают этикетку, на которой указы-
вают: наименование предприятия-изготовителя и его товарный знак,
полное наименование препарата, номер серии, номер контроля, дату
изготовления (месяц, год), срок годности, титр, количество доз в
ампуле, количество ампул в коробке, шт., условия хранения, обозна-
чений действующего стандарта.
1.4. При хранении в упаковке изготовителя в сухом и темном
месте при температуре (2-8 гр.С гемолиэин годен к употреблению в
течение 3 лет со дня изготовления. По истечении указанного срока
препарат может быть использован при показателе титра не менее
1:1000.
Титр гемолизина, указанный на этикетке коробки с препаратом,
является ориентировочным.
Титрование гемолизина проводят при получении каждой новой
серии.
1.5. Перед применением каждую ампулу с гемолизином просматри-
вают. Ампулы с наличием плесени, хлопьев, осадка и посторонней при-
меси, трещинами стекла, без надписей или этикеток выбраковывают.
2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
2.1. В РСК гемолизин используют в титре, взятом в зависимости
от методики постановки реакции при той или иной болезни.
Раствор гемолизина готовят на физиологическом растворе рН
6,8-7,2.
2.2. При расчете количества раствора гемолизина для постанов-
ки РСК следует исходить из его титра и кратности взятия его в реак-
цию, то есть при титре гемолизина 1:1500 удвоенный титр будет равен
1:750, для приготовления которого следует брать 0,1 куб.см гемолизина
и 74,9 куб.см физиологического раствора; утроенный титр будет равен
1:500, для приготовления которого следует брать 0,1 куб.см гемолизина
и 49,9 куб.см физиологического раствора, и т.д.
2.3. Для определения титра гемолитической сыворотки готовят
ее основное разведение 1:100, то есть 0,1 куб.см гемолизина и 9,9 куб.см
физиологического раствора.
Из основного разведения гемолизина (1:100) готовят разведения
от 1:500 до 1:2000, как указано в таблице.
Доза основного
разведения. куб.см
|
Доза физиологического
раствора, куб.см
|
Общий объем,куб.см
|
Получаемое разведение
|
0,2
|
0,8
|
1,0
|
1:500
|
0,2
|
1,3
|
1,5
|
1:750
|
0,2
|
1,8
|
2,0
|
1:1000
|
0,2
|
2,3
|
2,5
|
1:1250
|
0,2
|
2,8
|
3,0
|
1:1500
|
0,2
|
3,3
|
3,5
|
1:1750
|
0,2
|
3,8
|
4,0
|
1:2000
|
Для приготовления 2,5%-ной взвеси эритроцитов кровь у барана
берут утром, до кормления, из яремной вены во флакон со стеклянными
или металлическими бусами, встряхивают в течение 7-10 мин, затем
фильтруют через марлю. Эритроциты 3-4 раза отмывают физиологическим
раствором путем центрифугирования при 2500 мин.-' до полного обес-
печивания промывной жидкости. Из осадка эритроцитов готовят 2,5%-
-ную взвесь в физиологическом растворе.
По 0,2 куб.см каждого разведения гемолизина переносят в пробирки,
имеющие соответствующие надписи, начиная с наибольшего разведения
(1:2000). Затем в эти пробирки добавляют по 0,2 куб.см комплемента в
разведении 1:20, по 0,4 куб.см физиологического раствора и по 0,2 куб.см
2,5%-ной взвеси эритроцитов барана.
Одновременно в штатив ставят три пробирки контроля. В первую
пробирку контроля вносят 0,2 куб.см* гемолитической сыворотки в разве-
дении 1:100, 0,6 куб.см физиологического раствора и 0,2 куб.см 2,5%-ной
взвеси эритроцитов барана; во вторую пробирку вносят 0,2 куб.см комп-
лемента в разведении 1:20, 0,6 куб.см физиологического раствора и
0,2 куб.см 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана; в третью пробирку -
0,2 куб.см 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана и 0,8 куб.см физиологиче-
ского раствора (таблица 2).
Первая контрольная пробирка служит для контроля гемолитических
свойств гемолизина без комплемента, вторая - для контроля компле-
мента, третья - для установления резистентности эритроцитов барана.
Штатив с пробирками встряхивают и помещают в водяную баню при
температуре (37-38)гр.С на 10 мин.
Штатив с пробирками извлекают из бани и немедленно проводят
учет результатов реакции в проходящем свете.
Под титром гемолитической сыворотки следует понимать наимень-
шее количество его (наибольшее разведение), при котором в течение
10 мин при температуре (37-38)гр.С наступает полный (100%-ный) гемо-
лиз 0,2 куб.см 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана в присутствии
0,2 куб.см комплемента в разведении 1:20 в общем объеме жидкости 1,0 куб.см
Гемолитическую сыворотку считают активной при титре не менее
1:1000 и не обладающей гемолитическими свойствами при отсутствии
гемолиза эритроцитов в первой пробирке контроля.
Таблица 2.
Схема титрования гемолизина
Компоненты
|
Дозы компонентов, куб.см при разведении гемолизина
|
Номера контрольных
пробирок
|
|
1:1000
|
1:500
|
1:750
|
1:1000
|
1:1250
|
1:1500
|
1:1750
|
1:2000
|
1
|
2
|
3
|
1.Гемолизин
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
-
|
-
|
2.Компонент
(1:20)
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
-
|
0,2
|
-
|
3.Физраствор
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,6
|
0,6
|
0,8
|
4.Эритроциты
барана
(2,5% -ная
взвесь )
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
ВОДЯНАЯ БАНЯ (37-38)гр.С - 10 МИН.
|
Примерный
результат
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ЧГ
|
ЧГ
|
ОГ
|
ОГ
|
ОГ
|
Обозначения:ПГ-полный гемолиз,
ЧГ-частичный гемолиз,
ОГ-отсутствие гемолиза.
3.В случае несоответствия препарата требованиям, указанным в
настоящем Наставлении, снижении активности, неспецифичности ис-
пользование данной серии препарата прекращают и об этом в соответ-
ствии с указанием Главветупра Минсельхоза России от 8 мая 1992 года,
№ 22-7/28 "0 порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты оте-
чественного производства и закупаемые по импорту", сообщают на
предприятие-изготовитель, ЦНПВЛ и во Всероссийский государственный
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и серти-
фикации ветеринарных препаратов (ВГНКИ), одновременно в адрес ин-
ститута направляют 4 ампулы препарата (123022, Москва, Звенигород-
скос шоссе, 5; ВГНКИ).
Рекомендовано к регистрации Госветбиокомиссией 15 июня 1995 года
протокол № 2. ПВР 1.02.0024-95