Наставление
по применению набора листериозных бактериофагов
сухих для идентификации листерий и постановки
реакции нарастания титра фага
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
2. ПРИМЕНЕНИЕ НАБОРА
3. МЕТОДИКА ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ
4. МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ
(Минсельхозпрод России) Заместитель начальника
Департамента ветеринарии
В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
28.04.97г. № 13-7-2/922
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора листериозных бактериофагов
сухих для идентификации листерий и постановки
реакции нарастания титра фага
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1.Набор листериозных бактериофагов сухих для идентификации листерий и поста-
новки реакции нарастания титра фага включает два монофага:l-2А и l-4А.
1.2. Лиофилизированные листериозные бактериофаги имеют вид гомогенной таблетки
беловатого или слегка желтоватого цвета. После растворения они имеют вид прозрачной
желтой жидкости (цвет питательной среды).
9
1.3. Титр препаратов не должен быть ниже, чем 1 х 10.
1.4. Диагностический набор выпускается в коробке, содержащей по две ампулы каждого
фага. На этикетке коробки указывается наименование учреждения, выпустившего препарат,
название и состав набора, условие его хранения и срок годности. На ампулах должны быть
обозначены название фага, его титр, объем, дата изготовления, срок годности и номер
серии препарата.
1.5. Лиофилизированные бактериофаги могут быть использованы в течение 3 лет со дня
выпуска при хранении в закрытых помещениях в сухом темном месте при температуре 2-6
гр.С.
1.6. Набор бактериофагов позволяет выявить листерии в объектах ветнадзора реакцией
нарастания титра фага (РНФ) и идентифицировать свыше 85 % листериозных культур, так
как могут быть выделены штаммы листерий, которые не лизируются данными фатами.
1.7. В случае если содержимое ампулы полностью не растворяется, при наличии хлопьев,
посторонней примеси и плесени, а также нарушении целостности ампул, отсутствии этикеток,
препарат не пригоден для использования.
2.ПРИМЕНЕНИЕ НАБОРА
2. 1. Перед применением содержимое ампул растворяют 1 мл бульона Мартена или МПБ
и переносят в пробирки с соблюдением правил асептики. Растворенные бактериофаги не
пригодны к использованию при наличии осадка, хлопьев или помутнения.
2.2. Неиспользованные в день исследования растворенные бактериофаги могут быть
применены в дальнейшей работе в течение 5-10 сут при хранении в условиях холодильника
(2-6 гр.С).
2.3. Ампулы, пробирки и пипетки из-под бактериофага, а также выбракованный бактериофаг
обезвреживают кипячением (не менее 30 мин).
3. МЕТОДИКА ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ
3.1. Исследование проводят в бактериологических чашках, содержащих 2 %-ный агар Мартена
или МПА с глюкозой (0,5 %), разлитый накануне или в день исследования. Перед нанесением
испытуемой культуры поверхность отара необходимо подсушить. При подсушивании чашки
открывают и переворачивают вверх дном. Агар, разлитый накануне, подсушивают 20-30 мин.
при комнатной температуре, а разлитый в день исследования - 1-1,5 ч при 37°С.
3.2. Для идентификации используют 16-18-часовую агаровую культуру. Старые музейные
штаммы перед исследованием лучше освежить.
Выращенную при 22-28°С 16-18- часовую агаровую культуру засевают в бульон Мартена или
МПБ с глюкозой (0,5 %). Количество посевного материала должно быть таким, чтобы после
встряхивания в пробирке с бульоном образовалась легкая опалесценция. Культуры подращи-
вают в термостате (37 гр.С) 4 ч. После этого бактериальную взвесь наносят газоном на
поверхность подсушенного 2 %-ного агара в бактериологических чашках. Каждую культуру
подвергают не менее, чем 2-3 параллельным исследованиям.
В одной чашке можно одновременно проводить испытания двух культур. Для этого
поверхность агара делят пополам и на каждую из половин наносят по 0,1 мл исследуемых
культур, которые распределяют равномерно отдельным шпателем по отмеченному участку
агаровой пластинки.
Чашки с засеянными культурами выдерживают в термостате (37°С) 1-1,5 ч.
3.3. Затем на газон испытуемой культуры тонко оттянутой пастеровской пипеткой или
бактериологической петлей наносят по одной капле бактериофагов и отдельно каплю
стерильного бульона (контроль).
Предварительно место нанесения каждой капли отмечают карандашом по стеклу с
наружной стороны чашки. Расстояние между наносимыми каплями должно быть не менее
Через 15-20 мин после нанесения фата и бульона чашки помещают в термостат
(28°С) или оставляют при комнатной температуре (22 гр.С) в затемненном месте.
3.4.Учет результатов проводят через 16-24 ч. Культуру признают листериозной, если в
месте нанесения одного из бактериофагов образуется прозрачная зона лизиса или полу-
сливной лизис (в виде губки). Допускается наличие единичных колоний или сплошного
нежного роста вторичной культуры в зоне лизиса при интенсивном бактериальном росте
на остальной поверхности агара.
Если лизис культуры выражен нечетко (едва заметно место нанесения капли бакте-
риофага) или полностью отсутствует литическая реакция, культуры идентифицируют по
общепринятому бактериологическому способу.
4. МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА
4.1. Реакция нарастания титра фага (РИФ) - быстрый специфический метод обнаружения
листерий, обеспечивающий выявление возбудителя в исследуемом материале без выделения
его культуры.
4.2. РНФ основана на свойстве так называемого индикаторного бактериофага строго
специфично размножаться только в клетках гомологичного микроба. Размножение бактериофага
сопровождается увеличением количества его частиц и повышением титра.
4.3. РНФ рекомендуется использовать в качестве основного метода для обнаружения
листерий в кормах и объектах внешней среды, а также при диагностике листериоза.
4.4. Для исследования используют органы животных и людей, корма и объекты внешней среды.
4.5. В реакции применяют листериозные бактериофаги l-2А и l-4А, штаммы листерий 1
(9-127) и 11 (9-72) серогрупп. Питательные среды, содержащие 0,5 % глюкозы: мясопеп-
тонный бульон, 1,5 %- ный и 0,7 %-ный мясопептонный агар.
4.6. При постановке РИФ с пробами внутренних органов, кормов и почвы отвешивают 3 г
исследуемого материала, измельчают, помещают в колбу емкостью 50-100 мл и добавляют
30 мл МПБ. Смесь в течение 5-10 мин встряхивают, затем 9 мл переносят в бактериоло-
гическую пробирку № 1 (опытная).
Для исследования воды ее наливают в количестве 8 мл в пробирку № 1 (опытная), в
эту же пробирку добавляют 1 мл МПБ.
4.7. Бактериофаги используют в рабочем разведении (10000 фаговых корпускул в мл).
Для этого их растворяют МПБ до исходного объема, указанного на этикетке ампулы, а
затем на МПБ отдельными пипетками делают пять последовательных десятикратных разведений
4
(в последнем разведении титр бактериофага составит 1х 10 ).
Смесь фагов готовят путем смешивания равных объемов фага l-2А и l-4А в рабочем
разведении.
4.8. Для контроля титра бактериофага, который ставят один на группу анализов, прово-
димых одновременно, в пробирку № 2 (контроль) вносят 9 мл МПБ.
4.9. В пробирки № 1 и 2 вносят по 1 мл смеси фагов в рабочем разведении и выдерживают
их в течение 18-24 ч при комнатной температуре, после чего в пробирки добавляют по
1мл хлороформа.
Содержимое, заменив ватно-марлевую пробку на резиновую, тщательно встряхива-
ют и оставляют при комнатной температуре на 30-40 мин. Хлороформ оседает на дно,
надосадочную жидкость подвергают дальнейшим исследованиям.
4.10. При использовании смеси фагов из опытной и контрольной пробирок (№ 1 и 2)
переносят по 0,1 мл надосадочной жидкости в две пробирки, содержащие по 0,9 мл МПБ
(один ряд для обнаружения фага l-2А, другой - l-4А), а затем из каждой пробирки готовят
еще одно десятикратное разведение.
4.11. Готовят 1-миллиардную взвесь штаммов 1 и ii серогруппы по стандарту мутности
путем разведения суточной агаровой культуры в физиологическом растворе. Во все
пробирки с разведенным материалом добавляют по 0,1 мл взвеси штамма 1 серогруппы
для выявления фага l-2А или штамма ii серогруппы для обнаружения фага l -4А.
Содержимое пробирок засевают методом агаровых слоев по Грациа. Для чего накануне
дня исследования в бактериологические чашки Петри разливают по 10 мл 1,5 %-ного МПА;
(МПА можно разлить и в день исследования, но в этом случае поверхность агара необхо-
димо предварительно подсушить в течение 40-50 мин при 37 гр.С или 2 ч. при комнатной
температуре).
В пробирки после внесения индикаторных штаммов пипеткой добавляют по 2,5-3 мл
расплавленного и охлажденного до 48-50 °С 0,7 %-ного МПБ. Содержимое быстро и
тщательно перемешивают вращением пробирки между ладонями и выливают в чашку Петри.
Смесь легким покачиванием чашки равномерно распределяют вторым слоем на поверхности
1,5 %-ного МПА. Чашки оставляют на ровном месте на 20-30 мин.(до застывания 0,7 %-ного
МПА), затем переворачивают и инкубируют в течение 16 - 24 ч. при 28 °С или при комнат-
ной температуре.
4.12. Учет реакции
В опытных пробах и контроле титра фата подсчитывают число негативных колоний во
всех чашках. Негативные колонии - округлые, хорошо заметные на фоне бактериального
роста прозрачные участки, образующиеся в результате лизиса бактерий.
При учете результатов сравнивают количество негативных колоний на чашках соот-
ветствующих разведений.
4.13. Результаты реакции оценивают по увеличению титра бактериофага (количества
негативных колоний):
- увеличение количества негативных колоний в опытной пробе по отношению к кон-
тролю в 5 и более раз (хотя бы по одному из разведений) оценивается как положительный
результат, менее чем в 5 раз - отрицательный;
- сплошной лизис или лизис с островками оценивается как положительный результат.
4.14. При получении положительного результата РИФ дают заключение, что в исследуемом
материале (пробе) обнаружен возбудитель листериоза.
При получении отрицательного результата РНФ для окончательной постановки ди-
агноза необходимо провести бактериологическое исследование материала.
4.15. В случае несоответствия указанным требованиям, проявления неспецифических реакций
или снижения активности диагностикумов применение препарата данной серии прекращают и
об этом, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Минсельхоза России
от 8 мая 1992 года № 22-7/28 " О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты оте-
чественного производства и закупаемые по импорту", сообщают Всероссийскому государствен-
ному научно-исследовательскому институту контроля, стандартизации и сертификации ветери-
нарных препаратов (ВГНКИ) (123022, Москва, Звенигородское шоссе,5, ВГНКИ) и предприятию-
изготовителю набора.
С изданием настоящего Наставления на территории Российской Федерации не действуют
"Методические указания по применению набора лиофилизированных бактериофагов для
идентификации возбудителя листериоза", рекомендованные ГУВ МСХ СССР 25 мая 1978г.