Наставление
по применению глобулина флюоресцирующего
для диагностики бешенства животных
1. Общие положения
2. Подготовка материалов
3. Приготовление препарата
4. Проведение исследования
5. Учет реакции
6. Оценка результатов
7. Обеззараживание отработанных материалов
8. Предъявление рекламации
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ Заместитель начальника
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России) В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
11.03.97г. № 13-7-2/877
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению глобулина флюо-
ресцирующего для диагностики
бешенства животных
1. Общие положения
1.1. Флюоресцирующий глобулин для диагностики бешенства предназ-
начен для выявления вируса бешенства в головном мозге животных.
1.2. Флюоресцирующий глобулин для диагностики бешенства является
антирабическим глобулином, меченным флюоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ).
По внешнему виду представляет собой сухую пористую массу желтова-
то-оранжевого цвета, растворимую в дистиллированной воде в течение
2 мин.
1.3. На этикетке ампулы должны быть указаны: наименование препа-
рата, объем, рабочее разведение, номер серии, дата изготовления.
1.4. Диагностикум расфасован в ампулы по 1 мл, упакован в картон-
ные коробки по 10 ампул и рассчитан на проведение исследования 800
мазков. На коробке должна быть этикетка с указанием предприятия-изго-
товителя, его товарного знака, наименования препарата, количества ам-
пул, рабочего разведения, номера серии и контроля, даты изготовления,
срока годности, условий хранения и обозначения ТУ. В каждую коробку
вкладывают наставление по применению препарата.
1.5. Ампулы с глобулином хранят в сухом темном месте при темпера-
туре 2-8° С. Срок годности препарата 12 мес. при соблюдении условии
хранения.
1.6. При изменении цвета препаратам консистенции или плохой раст-
воримости применение его прекращают. Ампулы с препаратом, содержащие
плесень, посторонние примеси, а также с нарушением целостности, без
этикетки бракуют.
2. Подготовка материалов
2.1. Приготовление растворов
2.1.1. Приготовление раствора А
В мерную колбу внести 11,876 г nа2hpo4х2Н2o или 2Э,882 г
nа2hpo4х12Н2o, растворить и довести дистиллированной водой до объема
1 куб.дм.
2.1.2. Приготовление раствора Б
В мерную колбу внести 9,078 г КН2РО4, растворить и довести дис-
тиллированной водой до объема 1 куб.дм.
2.1.3. Приготовление забуференного физиологического раствора
(ЗБФР) рН 7,4+0,2.
К 808 куб.см раствора А добавить 192 куб.см раствора Б и 8,7 г nаСl.
Проверить рН, при необходимости рН корректируют добавлением 0,1 М
растворов КОН или НСl. Приготовленные растворы А, Б и ЗБФР используют
в работе в течение 2 мес, при температуре их хранения 2-б гр.С. Эабуферен-
ныи физиологический раствор используют для промывания стекол после ок-
рашивания.
2.2. Сухой глобулин растворяют стерильной дистиллированной водой
до указанного на этикетке ампулы первоначального объема и используют в
работе в течение двух недель при температуре хранения 2-б гр.С. Необходи-
мое для исследования количество растворенного глобулина дополнительно
разводят ЗБФР до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы и
используют в день приготовления.
2.3. Подготовка предметных стекол
Препараты из исследуемого материала приготавливают на хорошо от-
мытых и обезжиренных предметных стеклах.
Новые предметные стекла заливают смесью спирта-эфира (1:1) на 10
мин, протирают марлевым тампоном, не касаясь поверхности стекол паль-
цами, ополаскивают в 1-2 порциях свежей смеси спирта-эфира и хранят
в указанной смеси. Перед использованием стекла вынимают из раствора и
высушивают на воздухе.
Использованные стекла кипятят 2 ч в дистиллированной воде с до-
бавлением двух столовых ложек моющего средства на 5 куб.дм воды. Многок-
ратно промывают дистиллированной водой, не касаясь поверхности пальца-
ми, затем отмывают в растворе спирто-эфирной смеси, как при обработке
новых стекол.
3. Приготовление препарата
3.1. Приготовление мазков
Берут кусочки мозговой ткани из коры полушарий, аммонова рога,
мозжечка, продолговатого мозга и растирают в ступке каждый по отдель-
ности до образования однородной массы. На предметное стекло помещают
небольшой объем растертой ткани мозга, другим стеклом придавливают к
первому и делают мазок, как при гематологических исследованиях. Мазок
должен быть тонким.
3.2. Приготовление отпечатков
Из вышеуказанных отделов мозга ножницами вырезают кусочки ткани,
помещают на стекло так, чтобы поверхность среза была обращена кверху.
На поверхность среза прикладывают и слегка надавливают обезжиренное
предметное стекло, получая на нем отпечатки ткани.
3.3. При поступлении в лабораторию материала, хранившегося в
5О%-ном растворе глицерина, мозговую ткань промывают дистиллированной
водой не менее чем пять раз. При поступлении в лабораторию несвежей
мозговой ткани готовят только мазки.
3.4. После приготовления мазки и отпечатки высушивают на воздухе,
помещают в сосуд, наполненный охлажденным ацетоном и ставят в моро-
зильную камеру (-18±2)°С на 2-4 ч. В случае необходимости препараты в
ацетоне можно оставить на ночь. После фиксации препараты извлекают из
ацетона и высушивают на воздухе. Фиксированные мазки и отпечатки можно
хранить в закрытом сосуде при 2-5° С и использовать для исследования в
течение 3 дн.
3.5. Подготовка контрольных препаратов
Контрольные мазки и отпечатки готовят из мозга здоровых животных,
как описано в п.п. 3.1., З.2., 3.4.
4. Проведение исследования
4.1. Для анализа берут по 2 мазка или отпечатка из исследуемых
отделов мозга. На них наносят по 4 капли глобулина в рабочем разведе-
нии и распределяют его по всему препарату покачиванием стекла. Затем
предметные стекла помещают во влажную камеру (в чашку Петри на смочен-
ную водой фильтровальную бумагу) и ставят в термостат (37+1)гр.С на
30 мин.
Параллельно окрашивают контрольные препараты
4.2. После окончания окрашивания стекла промывают дистиллирован-
ной водой и двукратно забуференным физиологическим раствором по
10 мин. Затем препараты высушивают на воздухе в вертикальном положе-
нии .
4.3. Люминесцентную микроскопию проводят в день окраски мазков
под иммерсионной системой при увеличении 7х90, используя кювету с дис-
тиллированной водой в сочетании со светофильтрами: СЭС-14 (СЭС-7),
БС-2, ФС-1 (ФС-2), окулярные светофильтры: для МЛ-1 - Т-ТН (Т-2Н)
или ЖС-18 (ЖЗС-19), для МЛ-2 - n1 или n2. Сила тока 4,1 А.
5. Учет реакции
Окрашенные флюоресцирующим глобулином вирусные частицы имеют вид
флюоресцирующих светящихся на темном серо-зеленом фоне зеленых или
желто-зеленых структур, варьирующих по величине от мельчайших частиц
до частица сравнимых по величине с тельцами Негри (0,24-27 мкм). Реак-
цию оценивают по интенсивности специфического свечения в крестах:
+++ - четко видимое зеленое, зелено-желтое свечение
++ - умеренное зеленое, зелено-желтое свечение
+ - слабое зеленоватое свечение ("тени")
- - свечение отсутствует
В контрольных препаратах специфического свечения быть не должно.
6. Оценка результатов
Диагноз считается установленным, если в исследуемом препарате об-
наруживают флюоресцирующие структуры зеленоватого, зелено-желтого цве-
та с интенсивностью свечения не менее, чем в два креста, варьирующие
по величине от мельчайших частиц в виде точек до частиц, сравнимых по
величине с тельцами Негри.
При получении отрицательного результата исследование необходимо
повторить на таком же количестве мазков или отпечатков. При получении
повторного отрицательного результата исследование продолжают в соот-
ветствии с "Методическими указаниями по лабораторной диагностике бе-
шенства" .
7. Обеззараживание отработанных материалов
Материалы, содержащие вирус бешенства, и посуду автоклавируют в
течение 1 ч при 1,5 атм.
8. Предъявление рекламации
В случае выявления неактивности препарата или неспецифической ре-
акции его применение прекращают и в соответствии с указанием
ГУВ МСХ РФ от 08.05.92 г, № 22-7/28 "0 порядке предъявления рекламаций
на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту"
сообщают Всероссийскому государственному научно-исследовательскому
институту контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препа-
ратов (ВГНКИ, 123022, Москва, Звенигородское шоссе,5), предприя-
тию-изготовителю (ВНИиТИБП, 141142, Московская обл, Щелковский р-он,
п/о Кашинцево), Центральной научно-производственной ветеринарной лабо-
ратории (ЦНПВЛ, 111622, Москва, ул.Оранжерейная,23),
Одновременно 4 ампулы препарата упаковывают, опечатывают и на-
правляют с нарочным или почтой во ВГНКИ.
С утверждением настоящего наставления утрачивает силу "Временное
наставление по применению глобулина флюоресцирующего для диагностики
бешенства животных (на опытную серию)", утвержденное Департаментом ве-
теринарии МСХП РФ 11 октября 1994 г.