МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА УТВЕРЖДАЮ
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ Заместитель начальника
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России) В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
27.01.97г. № 13-7-2/835
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению 0-сывороток
флуоресцирующих сальмонеллезных
(для прямого метода иммунофлу-
оресценции).
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1.Флуоресуирующие сальмонеллезные 0-сыворотки предназначены
для обнаружения сальмонелл в патологическом материале, мясе и культу-
рах.
Комплексная сыворотка - для выявления сальмонелл, входящих в се-
рологические группы В, С1 , С2 , Д1 , Е1
Групповые адсорбированные сыворотки используют для определения
принадлежности обнаруженных сальмонелл к одной из указанных групп.
1.2. Сыворотки фасуют в ампулы по 1 куб.см и выпускают в наборах
следующего состава:
Комплексная сыворотка - 3 ампулы (флакона)
Сыворотка к группе В - 2 ампулы (Флакона)
Сыворотка к группе С1 - 2 ампулы (флакона)
Сыворотка к группе С2 -1 ампула (флакон)
Сыворотка к группе Д1- 2 ампулы (флакона)
Сыворотка к группе Е1- 1 ампула (флакон)
1.3. Флуоресцирующие сальмонеллезные 0-сыворотки - лиофильновысу-
шенные глобулины иммунных сывороток, меченные флуоресцеинизотиоциона-
том представляют собой пористую массу желто-оранжевого цвета, легко
растворимую в воде.
1.4. На крышку коробки с набором сывороток наклеивают этикетку на
которой указывают: наименование и товарный знак предприятия-изготови-
теля, наименование препарата, перечня сывороток в наборе с указанием
количества ампул (флаконов) по каждой сыворотке, обозначение настоящих
ТУ, дату изготовления, срок годности и условий хранения.
На этикетке ампулы (флакона) должно быть указано наименование сы-
воротки, номер серии, номер контроля, рабочее разведение, дата изго-
товления, срок годности.
1.5. Срок годности сывороток 2 года при условии хранения их в
темном месте при температуре от 4 до 10 гр.С.
Сыворотки с истекшим сроком годности можно применять, если они
сохранили специфичность и вызывают свечение гомологичных сальмонелл не
ниже, чем на три креста (+++) в разведении сыворотки 1:2.
1.6. Ампулы (флаконы) с трещинами, без этикеток, разжиженной мас-
сой, механическими примесями к применению не пригодны.
2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
2.1. Исследование материала и культур проводят в следующей после-
довательности: сначала мазки окрашивают комплексной сывороткой и при
появлении положительного результата серию мазков обрабатывают группо-
выми сыворотками.
2.2. Для приготовления рабочего разведения сухую сыворотку в ам-
пуле (флаконе) растворяют с соблюдением стерильности физиологическим
раствором рН 7,4 до указанного на этикетке первоначального объема.
Затем содержимое ампулы (флакона) переносят в стерильную пробирку
и хранят при температуре от 4 до 10 С.
Растворенную сыворотку перед применением разводят в нужном объеме
до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы (флакона), кото-
рое можно хранить в холодильнике не более двух суток.
2.3. В лаборатории рабочее разведение сыворотки каждой серии про-
веряют на препаратах, приготовленных из агаровых культур эталонных
штаммов гомологичных сальмонелл 16-20-часового роста. Если свечение
сальмонелл будет ниже трех крестов (+++), рабочее разведение сыворотки
соответственно уменьшают или срок окрашивания препаратов увеличивают
до 20-25 мин.
Проверять активность флуоресцирующих сывороток на старых музейных
и диссоциирующих культурах не разрешается.
2.4. Мазки из суточных культур, выращенных на жидких или плотных
средах, делают на тщательно обезжиренных предметных стеклах с расче-
том, чтобы в поле зрения микроскопа было около 100 клеток.
Мазки из патологического материала и мяса должны быть тонкие и
ровные. Площадь мазка около 1 см* обозначают восковым карандашом на
обратной стороне стекла.
На одном стекле делают не более трех мазков из разных культур или
органов.
Одновременно из каждого материала (культуры) готовят необходимое
количество мазков для окрашивания комплексной и групповой сыворотками.
Мазки, высушенные на воздухе, Фиксируют метиловым спиртом (мета-
нолом) 5 мин. или этиловым спиртом (этанолом) 15 мин. и высушивают.
2.5. Перед окрашиванием препараты помещают строго горизонтально
на мостике во влажной камере (чашке) для предупреждения высыхания сы-
воротки. На каждый мазок наносят 2 капли разведенной сыворотки и расп-
ределяют ее по всей поверхности мазка. Окрашивание препарата длится
обычно 15 мин. при комнатной температуре или в термостате при 37 гр.С.
Для лучшего окрашивания чашки с препаратами через 7-8 мин. надо слегка
покачать.
Промывают препараты Физиологическим раствором рН 7,4 в течение
5-10 мин со сменой раствора 2-3 раза. Отмытые препараты ополаскивают
дистиллированной водой и подсушивают.
2.6. На мазок наносят небольшую каплю смеси, состоящей из Э час-
тей глицерина и одной части 1/5М ФосФатного буФера рН 8,0 и накрывают
покровным стеклом. Для иммерсии употребляют неФлуоресцирующее масло
или его заменитель, приготовленный из чистого диметилФталата (100 мл)
и наФталина сублимированного (1,75 г) или тимола чистого (5 г).
2.7. Мазки просматривают под люминесцентным микроскопом в синеФи-
олетовом спектре при увеличении 90х5.
2.8. Окрашенные Флуоресцирующей сывороткой сальмонеллы имеют све-
тящийся периФерический контур (ободок). Это характерное свечение кон-
тура визуально оценивается в крестах:
++++ - сияющее зеленовато-желтоватое свечение,
+++ - яркое желтовато-зеленоватое свечение,
++ - умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свечение
отчетливого заметного контура,
+ - слабое беловатое свечение различимого контура,
- - клетки в виде сероватых теней, контур отсутствует или слабо
заметен на отдельных участках периферии клеток (не у всех
микробов).
Для контрастирования неспецифического свечения тканевых элементов
и гетерологичных бактерий при исследовании патологического материала и
мяса может быть применен бычий альбумин, меченный родамином, в смеси с
сальмонеллезной флуоресцирующей сывороткой.
Вначале проводят определение рабочего разведения меченого альбу-
мина в соответствии с наставлением по его применению,
Рабочую смесь готовят следующим образом: флуоресцирующую сальмо-
неллезную сыворотку и меченый альбумин разводят отдельно физиологичес-
ким раствором хлорида натрия (рН 7,2-7,4) на одно разведение меньше
рабочего и смешивают в равных объемах в пробирке.
Окрашивание и подготовку препаратов к микроскопии проводят, как
указано в п.п. 2.5., 2.6.
При правильно выбранном разведении смеси сальмонеллы четко флуо-
ресцируют зеленоватым цветом на оранжево-красном фоне мазка.
Примечание: бычий альбумин, меченый родамином, готовит институт
эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи АМН Рф (Москва, 123098,
ул.Гамалеи, 18).
2.9. Положительным результатом считают свечение типичных для саль-
монелл форм, оцениваемое не ниже чем два креста (++) при условии, что
в контрольных препаратах, окрашенных рабочим разведением гетерологичес-
кой сывороткой, оно оценивается отрицательно.
Собственное бесконтурное свечение некоторых микробов всегда оце-
нивается отрицательно, хотя иногда оно хорошо выражено.
2.10. В случае более яркого свечения атипичных форм или свечения
типичных для сальмонелл форм на один крест (+), результат микроскопии
считают сомнительным и исследование повторяют.
При этом после фиксирования мазков необходимо усреднить реакцию в
препарате, для чего на мазок наносят на 10 мин фосфатный буфер рН 7,4
со сменой раствора через 5 мин , затем препарат ополаскивают дистилли-
рованной водой, подсушивают и окрашивают, как указано в п. 2.5.
3. В случае несоответствия препарата требованиям, указанным в
настоящем наставлении, наличии неспецифических реакций или установле-
нии слабой активности сывороток после применения данного препарата,
применение их прекращают и в соответствии с указанием Главного управ-
ления ветеринарии Минсельхоза России от 8 мая 1992 г. М 22-7/28 "0 по-
рядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного произ-
водства и закупаемых по импорту", сообщают об этом предприятию-изгото-
вителю. Всероссийскому государственному научно-исследовательскому инс-
титуту контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов
(123022, Москва, Звенигородское шоссе,5) и Центральной научно-произ-
водственной ветеринарной лаборатории (ЦНПВЛ). Одновременно с этим при
наличии невскрытого набора в институт направляют с нарочным один набор
с сыворотками.
С утверждением настоящего Наставления на территории Российской
Федерации утрачивает силу Наставление по применению 0-сывороток флуо-
ресцирующих сальмонеллезных, утвержденное Главным управлением ветери-
нарии Министерства сельского хозяйства СССР 30 декабря 1971 года.
Одобрено Советом по ветеринарным препаратам. Протокол № 5 от 10
октября 1996 года (ПВР 1.05.0238-96).