Наставление
               по применению набора для диагностики 
                  токсоплазмоза животных в РСК






1.ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

2.ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО НАБОРА

Таблица 1.
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Таблица 2.
СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА

     МИНИСТЕРСТВО
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
 РОССИЙСКОЙ  ФЕДЕРАЦИИ

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                               УТВЕРЖДАЮ
                                               Заместитель начальника
04.12.97г. n 13-7-2/1107                       Департамента ветеринарии
                                                   В.В.Селиверстов

Наставление
по применению набора для диаг-
ностики токсоплазмоза животных
в РСК

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Набор предназначен для серологической диагностики токсо-
плазмоза животных.

1.2. Набор для диагностики токсоплазмоза животных содержит:

- четыре ампулы (по 1 куб.см) токсоплазменного антигена (ТА);
- четыре ампулы (1 куб.см) токсоплазменной сыворотки крови,
- две ампулы (1 куб.см) нормальной сыворотки крови овец,

1.3. Антиген представляет собой мелкопористую массу белого
цвета, сыворотки - пористую аморфную массу соломенно-желтого цвета,
запаянные в ампулы, без посторонней примеси с содержанием влаги не
более 3%.

1.4. На ампулы с антигеном и сыворотками наклеивают этикетку,
на которой указывают: наименование препарата, объем растворителя,
номер серии, дату выпуска и титр.

1.5. На коробку с антигеном и сыворотками наклевают этикетку,
на которой указывают: наименование и товарный знак предприятия-
изготовителя и его адрес, наименование препарата, количество ампул,
количество растворителя, необходимого для растворения антигена в
ампуле и получения его рабочего титра, разовая доза, количество доз
в коробке, номер серии, дата выпуска (месяц, год), срок годности,
условия хранения, номер контроля, обозначение ТУ.

1.6. Набор для диагностики токсоплазмоэа животных хранят сухом
темном помещении при температуре 4-8°С·

Срок годности диагностикумов, входящих в набор - 24  месяца
со дня изготовления.

1.7. При отсутствии маркировки (этикетки), нарушении целост-
ности ампул, изменении цвета и консистенции содержимого, наличии
хлопьев и посторонних примесей при растворении, а также при непол-
ном растворении  компоненты бракуют.

2.ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО НАБОРА

2.1.Подготовка диагностического набора к работе:
-содержимое ампулы с антигеном растворяют физиологическим
раствором в соответствии с указанием на этикетке рабочим титром;
-содержимое ампул с токсоплазменной и нормальной сыворотками 
растворяют физиологическим раствором в соответствии с указанием
на этикетке рабочим титром.

Растворенные таким образом антиген и сыворотки используют
в день проведения исследования. Оставшиеся неиспользованные ан-
тиген и сыворотки допускается применять для исследования в тече-
ние 15 дней при условии хранении в морозильной камере холодильника.

По истечению этого срока указанные компоненты реакции ути-
лизируют.
 
2.3.Компоненты реакции:
-физиологический раствор, рН    7,4.
-эритроциты барана, трижды отмытые физиологическим раствором
центрофугированием при 2000-3000 об,мин. В течение 15-20 мин. Из
осадка отмытых эритроцитов готовят 2,5-3% взвесь на физиологическом
растворе;
-гемолитическая сыворотка. В реакцию гемолизин берут в
утроенном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1:1200,
в реакции используют сыворотку в разведении 1:400, для чего к 0,1
куб.см сыворотки прибавляют 39,9 куб.см физиологического раствора.

Перед работой 2,5-3% взвесь эритроцитов и разведенную по ут-
роенному титру  гемолитическую сыворотку смешивают в равных объе-
мах и гемолитическую систему ставят в водяную баню при 37-38 гр.С
на 20 мин. Для сенсибилизации эритроцитов;

-комплемент-сыворотка крови морских свинок.

Лучше всего использовать сухой комплемент, выпускаемый биопромышленностью.
Для реакции используют комплемент в рабочем титре, который определяют в день
ее постановки;
-токсоплазменный антиген в рабочем титре;
-исследуемые и контрольные сыворотки крови в разведениии
1:5, инактивированные прогреванием в течение 30 мин. при температу-
ре: для крупного рогатого скота, овец и свиней при 57 гр.С, для ло-
шадей - 58-59 гр,С, для птиц, крыс, мышей - 60 гр.С, для ослов и му-
лов - 64 гр.С, для кроликов и зайцев, собак, кошек, лисиц -65 гр,С.

2.4.Для титрования комплемента и контролей реакции исполь-
зуют нормальные и токсоплазменные сыворотки крови овец из набора,
а также сыворотку крови из исследуемой партии.

2.5.Титрование комплемента.

2.5.1.В день постановки реакции производят титрование ком-
племента, для чего его разводят физиологическим раствором 1:20.

Комплемент титруют по нормальной и заведомо положительной 
сывороткам в присутствии антигена и без него, а также по 2-3 ис-
следуемым сывороткам в безантигенном ряду для определения их ан-
тикомплементарных свойств и правильного выбора титра комплемента.

В безантигенные ряды пробирок вместо антигена вносят по 0,2 
куб.см физиологического раствора. 

Схема титрования комплемента дана в таблице 1.

2.5.2.После выдерживания пробирок в водяной бане при 37-
38 гр.С производят учет результатов титрации комплемента.

Схема определения титра комплемента приведена в таблице 2.

2.5.3.Титром комплемента является наименьшая его доза, ко-
торая дает полный гемолиз взвеси эритроцитов. В приведенной схеме
(табл.2) титр комплемента в разведении 1:20 равен 0,06, так как
в 1,2,4,5 рядах в пробирках с 3 по 10 отмечается полный гемолиз
эритроцитов, при соответствующей задержке гемолиза во всех пробир-
ках 3 ряда (положительная сыворотка + антиген).

2.5.4.Учитывая возможные антикомплементарные свойства анти-
гена в основной опыт комплемент берется с надбавкой  к найденному
титру (в нашем примере он равен 0,06).Для токсоплазменного ан-
тигена делают надбавку 10-20% для РСК. Тогда в объеме 0,2 куб.см (ра-
зовой дозы комплемента) рабочий титр комплемента в разведении
1:20 будет состовлять для РСК 0,06 + 10-20% и равняться 0,066-0,072.

Таблица 1.

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Обозначения: ПГ-полный гемолиз, ЧГ-частичный гемолиз,
             ЗГ-задержка гемолиза.

Если в основной опыт взят  рабочий титр 0,072, то для получения
разовой дозы комплемента (0,02 куб.см) к нему  нужно добавить 0,128 куб.см
Физиологического раствора (0,072+0,128). Из полученного
Соотношения комплемента и физиологического раствора определяют общее 
Количество комплемента в рабочем титре, необходимое для постановки
основного  опыта. Например, если в опыте будет использовано 100 проби-
рок, то для постановки реакции  потребуется 20 куб.см комплемента (0,2 куб.см 100).
Это количество получают путем добавления  к 7,2 куб.см разведен-
ного  1:20 комплемента 12,8 куб.см физиологического раствора (0,072+0,128 *
100=20куб.см).

Таблица 2.
СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА

Ряд про-
бирок
в шта-
тиве

Титр комплемента
---------------------
   Ингредиенты

                            Номера пробирок

      Контроль

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ком-
пле-
мента

гем.
сис-
темы

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

    1.

Нормальная сыворотка,антиген,
комплемент,
гем.система

++++

 ++

  -

  -

  -

  -

  -

  -

  -

  -

          -

 ++++

    2.

Нормальная сыворотка,физиоло-
гический раствор,комплемент,
гем.система

+++

++

-

-

-

-

-

-

-

-

           -

  ++++

     3.

Положительная 
сыворотка,антиген,
комплемент,гемсистема

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

            -

  ++++

    4.

Положительная сыворотка,физиологи-
ческий ратвор,комплемент,
гем.система

++++

++

-

-

-

-

-

-

-

-

             -

  ++++

    5.

Сыворотка из исследуемой партии,
физиологический
раствор,комплемент ,
гем.система

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

            -

      -

Обозначения: + степень задержки  гемолиза       
- полный гемолиз



2.6.Постановка основной реакции.

2.6.1.Реакция связывания комплемента ставится в объеме
1 куб.см; антиген, сыворотку и комплемент берут в дозе 0,2 куб.см, а ге-
молитическую систему-0,4 куб.см.

2.6.2.В основную реакцию наряду с испытуемыми сыворотками
берут в качестве контроля заведомо положительные и отрицательные
сыворотки, с которыми реакция ставится также как с испытуемыми.

2.6.3.Для постановки основной реакции берут два ряда проби-
рок: 1-й опытный и 2-й ряд-контрольный (контроль на антикомпле-
ментарность сывороток).Каждую сыворотку в разведении 1:5 вносят
по 0,2 куб. в опытную и контрольную пробирки. Антиген в рабочем
титре добавляют по 0,2 куб.см только в пробирки 1-го ряда, во второй
контрольный ряд вместо антигена вносят по 0,2 куб.см физиологи-
ческого раствора. После этого во все пробирки вносят  по 0,2 куб.см
комплемента в рабочем разведении. Одновременно ставят контроли:
антикомплементарности антигена (0,2 куб.см антигена + 0,2 куб.см
комплемента + 0,2 куб.см физиологического раствора),его гемотоксич-
ности (0,2 куб.см антигена +0,4 куб.см физиологического раствора) и
стабильности гемолитической системы (0,6 куб.см физиологического
раствора).

2.6.4.Все пробирки хорошо встряхивают для смешивания ингре-
диентов и ставят в водяную баню при 37-38 гр.С на 20 мин.

2.6.5.После выдерживания в водяной бане в пробирки добав-
ляют по 0,4 куб.см гемолитической системы, затем их встряхивают
и ставят в водяную баню при 37-38 гр.С на 20 мин.

2.6.6.Результаты реакции учитывают сразу после выдержки в
водяной бане и на следующий день при условии хранения реакции в
холодильнике при +2+8 гр.С.

2.7.Учет результатов реакции.

2.7.1.Учет результатов реакции начинают с контролей:
-контроль сывороток (2-й ряд)-во всех пробирках должен
быть полный гемолиз. При задержке гемолиза результаты по данной
сыворотке не учитывают и проводят ее переисследование;
-заведомо отрицательные сыворотки должны дать полный гемо-
лиз;
-заведомо положительные сыворотки должны дать задержку
гемолиза;
-контроль антигена на антикомплементарность- должен быть
полный гемолиз; на гемотоксичность - задержка гемолиза;
-контроль стабильности гемолитической системы - должна 
быть задержка гемолиза.

2.7.2.Результаты реакции учитывают визуально и оценивают в
крестах или в % задержки гемолиза эритроцитов.

Отмечают результаты реакции крестами: положительная реакция
++++ или +++; сомнительная реакция ++ или +; отрицательная ре-
акция -.

Степень задержки гемолиза, выраженная крестами, соответствует
следующим процентам гемолиза эритроцитов: ++++ гемолиз эритроцитов
от 0 до 10%, +++ от 10 до 40; ++ от 40 до 70; + от 70 до 90;
- от 90 до 100%.

Результаты исследования обозначают : положительная, сомнительная,
отрицательная с указанием крестов.

Для внесения объективности в определении результатов реакции
крестами рекомендуется оценку проводить в процентах гемолиза. Для
этого из реакции выбирают пять пробирок с полным гемолизом и жидкость
сливают в одну пробирку.В этой жидкости 100% гемолиза. Из
нее готовят разведение с различным процентом гемолизом (от 10 до
90%) по следующей схеме:

                                                               номер пробирки

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Гемолизированная жидкость

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Физиологический раствор

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

Процент гемолиза

10

20

30

40

50

60

70

80

90

"Стандартные" пробирки готовят перед учетом реакции. Степень
гемолиза  в каждой пробирке с исследуемой сыворотками определяют
путем сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках,и
процент сравнения со степенью гемолиза  в "стандартных" пробирках, и
процент гемолиза выражают в крестах.

2.7.3.Результаты реакции считают положительными при задержке
гмолиза эритроцитов не менее чем на +++ в разведении 1:5.

Сыворотки крови  от животных, которые дают сомнительную реакцию,
Подлежат повторному исследованию в РСК через 30 дней после первого
Исследования. Двукратную сомнительную реакцию считают положительной.

2.7.4.В случае необходимости проводят титрацию выявленных
положительных сывороток в разведениях 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, !:80,
1:160 и т.д. (см табл,3).Титром испытуемой сыворотки считают ее
наибольшее  разведение, дающее задержку  гемолиза эритроцитов.
В приведенном примере  таблицы 3).Титром испытуемой сыворотки считают
ее наибольшее разведение, дающее задержку гемолиза эритроцитов. В при-
веденном примере таблицы 3 титр исследуемой сыворотки равен 1:40.

Таблица 3.
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ

Ингредиенты

Разведение сыворотки

Контроль 
сыворотки
     1:5

1:5

1:10

1:20

1:40

1:80

1:160

Исследуемая сыворотка

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

    0,20

Антиген в рабочем титре

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

       -

Комплемент в рабочем титре

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

0,20

    0,20

Физиологический раствор

-

-

-

-

-

-

       -

                               Водяная баня 37-38 гр.С-20мин.

Гемолитическая система

0,40

0,40

0,40

0,40

0,40

0,40

     0,40

                               Водяная баня 37-38 гр.С-20мин.

Результат

++++

++++

++++

+++

++

   -

       -

2.7.5.Животных, положительно реагирующих в РСК на токсоплазмоз
считают подозрительными по заболеванию.

Диагноз на токсоплазмоз устанавливают в соответствии с "Мето-
дическими указаниями по лабораторной диагностике токсоплазмоза 
животных", утвержденными ГУВ МСХ СССР 21 января 1985 года.

2.7.6.При появлении неспецифической реакции или установлении
слабой активности антигена или сывороток применение набора данной
серии прекращают и в соответствии с указанием Главного упрвления
ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации 
(Минсельхоза России) от 8 мая 192 г. №22-7/28 "О порядке предъявления
рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые 
по импорту" сообщают об этом Всероссийскому государственному
научно-исследовательскому институту контроля, стандартизации и
сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, 123022, Москва,
Звенигородское шоссе, 5),ЦНПВЛ (116622, Москва, ул. Оранжерейная,
23) и предприятию-изготовителю.

Одновременно в адрес института при наличие невскрытых наборов
данной   серии один набор направляют с нарочным.

С утверждением настоящего Наставления на территории 
Российской Федерации на действует "Наставление по применению
набора для диагностики токсоплазмоза животных в РСК (РДСК)",
утвержденное Главным управлением ветеринарии Государственного
агропромышленного комитета СССР 22 апреля 1986 г.

Рекомендовано к регистрации Советом по ветеринарным препаратам
10 октября 1996г., протокол №5, ПВР 1.05.0333-96.