Наставление
по применению набора компонентов
для диагностики вирусной диареи-болезни
слизистых крупного рогатого скота методом
иммуноферментного анализа
1. Общие положения
2. Взятие и подготовка материала
3. Подготовка компонентов набора для постановки реакции
4. Постановка реакции
5. Учет результатов
6. Порядок предъявления рекламаций
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ УТВЕРЖДАЮ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Заместитель начальника
(Минсельхозпрод России) Департамента ветеринарии
В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
15.07.97г. № 13-7-2/1012
Наставление
по применению набора компонентов
для диагностики вирусной диареи-
болезни слизистых крупного рогатого
скота методом иммуноферментного
анализа
1.Общие положения
1.1.Набор для иммуноферментной диагностики вирусной диареи
крупного рогатого скота применяют для обнаружения антигена вируса
диареи-болезни слизистых в исследуемом материале.
1.2.Набор рассчитан на исследование 188 проб материала и
содержит следующие компоненты:
-антиген специфический лиофилизированный 0,2 мл,1ампула (№1);
-антиген отрицательный лиофилизированный 0,2 мл,1ампула (№2);
-иммуноглобулины антивирусные, лиофинизированные 1,0 мл,2 ампулы (№3);
-Конъюгант иммуноферментный лиофинизированный 1,0 мл,2 ампулы (№4);
-5-аминосалициловая кислота лиофинизированная 1,0 мл,2 ампулы (№5);
-гидроперит 1,0 мл, 2 ампулы (№6);
-детергент (твин-80 или твин-20) 1,0 мл, ампула (флакон) (№7);
-фосфатно-буферный раствор 0,01М 20 мл,1флакон (№8);
-натрий хлористый 11,6г., 1 флакон (№9);
-плашки полистироловые,2 штуки.
1.3.Биологические компоненты набора представляют собой сухую
гомогенную аморфную массу, белого с сероватым оттенком цвета. При
добавлении в ампулы дистиллированной воды в объеме, равном объему до
высушивания, содержимое должно раствориться в течение 1-2 мин. И пред-
ставлять собой прозрачную и слегка опалесцирующую жидкость.
Химические компоненты набора.5-аминосалициловая кислота должна
Представлять собой сухую гомогенную аморфную массу фиолетово-коричне-
вого цвета; фосфатно-буферный раствор - прозрачная бесцветная жидкость:
гидроперит и хлористый натрий должны представлять собой сыпучий неод-
нородный порошок, содержащий гранулы разных размеров белого цвета;
твин-80 или твин-20-вязкая, тягучая, маслянистая жидкость соломенно-
желтого цвета.
1.4.На ампуле и флаконе с каждым компонентом должна быть этикетка
с указанием: краткого названия компонента и его номера, количества
препарата, номера серии и даты изготовления.
1.5.Этикитированные ампула и флаконы укладывают в коробки по ГОСТ
12301, представляющие из себя наборы компонентов для обнаружения
антигена вируса диареи-БС крупного рогатого скота методом иммуно-
ферментного анализа. В каждую коробку с набором вкладывают наставление
по применению.
1.6. На каждую коробку с набором компонентов для диагностики ВД-БС
наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование предприятия
изготовителя, полное название набора, перечень компонентов, входящих
в набор, количество ампул (флаконов) каждого компонента, количество
препарата в каждой ампуле (флаконе), номер серии набора, номер конт-
роля, дату изготовления (месяц, год), срок годности, условия хранения
и обозначение настоящих ТУ.
1.7. Срок годности набора компонентов - 12 месяцев при соблюдении
условий хранения в сухом темном месте при температуре 4-8 гр.С. Допуска-
ется хранение при минусовой температуре.
1.8. При отсутствии маркировки (этикетки, нарушении целостности
ампул (флаконов), изменении цвета и консистенции содержимого, наличие
хлопьев и посторонних примесей при растворении, а также при неполном
растворении компоненты бракуют.
2. Взятие и подготовка материала
2.1. В качестве испытуемого материала используют слизистой носовой
перегородки, миндалины, трахею, пораженные (изъязвления, воспаления)
участки слизистой оболочки носа, толстого и тонкого кишечника. От
больных в острой стадии заболевания животных берут пробы носовой слизи
при ринитах и фекалии при поносах.
2.2. Для получения 25-50% суспензии кусочки материала тщательно
измельчают ножницами и растирают в фарфоровой ступке до образования
кашицеобразной однородной массы. Полученную суспензию промораживают
в течение 18-20 ч. при минус 20 гр.С , оттаивают и осветляют центрифуги-
рованием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сли-
вают в стерильную посуду, добавляют антибиотики (пеницилин, стрепто-
мицин по 1000 ед/мл, инкубируют при 4 гр. С в течение 2-3 ч и используют
для исследования. Допускается хранение проб в замороженном состоянии.
3. Подготовка компонентов набора для постановки реакции
З.1. Растворение и разведение иммуноглобулинов и других компонен-
тов реакции проводят на 0,01М калий-фосфатном буфере (рН 7,2-7,4)
для приготовления которого содержимое флаконов (№8) (0,01М калий-
фосфатный буфер) и №9 (натрий хлористый) растворяют в 2 л дистилли-
рованной воды и хранят при 4-8 гр.С в течение месяца, (ФБР).
3.2. Содержимое ампулы с иммуноглобулинами растворяют в 10 мл ФБР.
3.3. Содержимое ампул со специфическим и отрицательным антигенами
растворяют в 0,2 мл ФБР каждую, разливают по 0,1 мл и хранят в замо-
роженном состоянии до использования в реакции.
3.4.Для промывания плашек и разведения компонентов при постановке
реакции готовят ТФБР: к 1л ФБР добавляют 0,5 мл твина-20 или твина-
80 (флакон №7) и перемешивают до полного растворения.
3.5. Содержимое ампулы с иммуноферментным конъюгатом растворяют
в 10 мл ФБР.
3.6. Субстратную смесь готовят непосредственно перед использова-
нием в реакции следующим образом. Содержимое ампулы с 5-аминосалици-
ловой кислотой (№5) растворяют в 10 мл подогретой до 30-40 гр.С дистилли-
рованной воды, охлаждают и вносят в полученный раствор содержимое ампу-
лы с гидроперитом (№6).
4. Постановка реакции
4.1. На первом этапе реакции разведенные иммуноглобулины (п.3.2.)
вносят по 0,1 мл в лунки полистироловой плашки, закрывают крышкой,
инкубируют в течение 2 ч. при 36-37 гр.С и затем 18 ч. при 4 гр.С. Удаляют
раствор иммуноглобулинов и 3-4 раза отмывают лунки ТФБР.
4.2. На втором этапе реакции во все лунки плашки вносят по 0,1 мл
ТФБР. При качественной реакции (ответ "да" или "нет") в первую лунку
первого ряда вносят 0,1 мл испытуемой пробы, пипетируют и 0,1 мл
раствора удаляют и т.д. В одну из лунок вносят 0,1 мл специфического
антигена, пипетируют и 0,1 мл смеси удаляют. Таким же образом вносят
отрицательный антиген. Плашки инкубируют в термостате 1,5-2ч. при
36-37 гр.С и затем отмывают лунки плашки от несвязавшихся антигенов.
4.3. Иммуноферментный конъюгат вносят по 0,1 мл в отмытые лунки
плашек, инкубируют в термостате при З6-37 гр.С 1,5-2 ч и вновь трижды
отмывают раствором ТФБР.
4.4. Затем в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси, которую
готовят непосредственно перед использованием в реакции.
4.5. Результат реакции учитывают через 40-60 мин по изменению
окраски образовавшегося реакционного продукта.
5. Учет результатов
Результаты реакции учитывают через 40-60 мин визуально по появле-
нию краски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до
светло-коричневого цвета.
Оценку достоверности присутствия специфического антигена проводят
по схеме:
- интенсивнее коричневое окрашивание, коричневое окрашивание -
положительный результат;
- светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;
-окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного
контроля - отрицательный результат.
6. Порядок предъявления рекламаций
6.1. В случае несоответствия препарата предъявляемым требованиям,
снижении активности и специфичности, применение данной серии прекраща-
ют, и , в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии
Минсельхозпрода России от 8 мая 1992г. №22-7/28 " О порядке предъявления
рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемых
по импорту', сообщают об этом предприятию-изготовителю, Всероссийско-
му государственному научно-исследовательскому институту контроля,
стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва ,
Звенигородское шоссе, 5) и ЦНПВЛ.
При наличии невскрытых наборов, одновременно с этим в институт на-
правляют нарочным 1 набор. Образцы препарата транспортируют с соблю-
дением условий хранения препарата.
С утверждением настоящего Наставления не действует Временное настав-
ление по применению "Набора компонентов для диагностики вирусной
диареи-болезни слизистых крупного рогатого скота методом иммунофер-
ментного анализа" за № 22-7/81, утвержденное Главным управлением
ветеринарии 20 августа 1992 года.