Наставление
по применению тест-системы для выявления
вируса и определения титра антител к вирусу
классической чумы свиней (КЧС) в реакции
микро нейтрализации с помощью цитохимического
варианта иммуноферментного метода (ЦВИА)
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
СОСТАВ НАБОРА
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
ВЗЯТИЕ И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДИАГНОЭА НА КЧС
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ
ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ
УЧЕТ И ОЦЕНКА РЕАКЦИИ
ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
24.03.99г. n 13-7-2/1541
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы для выявления
вируса и определения титра антител к вирусу
классической чумы свиней (КЧС) в реакции
микро нейтрализации с помощью цитохимического
варианта иммуноферментного метода (ЦВИА)
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Метод предназначен для выявления вируса КЧС в крови и суспензии органов от
павших или вынужденно убитых животных при подозрении на классическую чуму свиней.
Метод позволяет определить биологическую активность (титр) вакцинного штамма вируса на
различных стадиях изготовления вакцины, а также выявлять титр специфических
нейтрализующих антител в сыворотке крови свиней и лабораторных животных. Расчет титра
вируса и титра противовирусных антител в рефереинтных и тестируемых сыворотках
рассчитывают по таблицам с использованием метода Кербера.
1.2.Компоненты набора выпускают в закрытых флаконах (ампулах). На ампулы
(флаконы) с каждым компонентом наклеивают или несмываемой краской наносят этикетки с
указанием: для специфических антигенов, иммуноглобулинов, пероксидазных конъюгатов
краткого названия компонента, количества препарата в ампуле, номера серии, даты
изготовления (месяц, год) и рабочего разведения препарата, а для неспецифических
компонентов - краткого названия компонента, количества препарата в ампуле (флаконе),
номера серии и даты изготовления (месяц, год).
1.3.На каждую коробку с тест-системой наклеивают этикетку, в которой
указывают: наименование и товарный знак предприятия изготовителя, полное название набора,
перечень компонентов, входящих в набор, количество ампул (флаконов), титр (рабочее
разведение), номер серии набора, номер контроля, дату изготовления набора, срок годности,
условия хранения и обозначения ТУ.
1.4.Диагностическую тест-систему транспортируют при температуре от 2 до 8 гр.С. Не
допускается хранение при минусовой температуре.
1.5. Срок годности тест-системы - 12 мес со дня изготовления.
1.6. Тест-система обеспечивает проведение исследований 45 проб испытуемого
материала (сывороток крови).
СОСТАВ НАБОРА
Диагностический набор для выявления антител методом ИФА состоит из упакованного в
коробку комплекта препаратов:
1. Лиофилизированный иммуноглобулин (сыворотка) кролика (igg, 10-20 мкг/О,1 куб.см ),
специфический к вирусу КЧС (№ 1 ) - 1 ампула, содержащая 0,1 куб.см .
2. Лиофилизированный атенуированный вирус КЧС, штамм «ЛК-ВНИИВВиМ» (№2) - 1
ампула, содержащая 1,0 см (0,5 lgИД 50/0,5 куб.см)
3. Лиофилизированный положительный контрольный иммуноглобулин (igg) сыворотки
свиньи (№3) - 1 ампула, содержащая 0,2 куб.см.
4. Лиофилизированный отрицательный контрольный иммуноглобулин (igg) сыворотки
свиньи (№4) - 1 ампула, содержащая 0,2 куб.см.
5. Лиофилизированный конъюгат антител, специфических к igg кролика,
конъюгированных с пероксидазой хрена (№5) - 1 ампула, содержащая 0,2 куб.см.
6. 0,05 М ацетатный буфер, рН 5,0 (№6) - 1 флакон - 10 куб.см.
7. 1 М концентрат фосфатно-буферного раствора (ФБР), рН 7,2-7,4 (n7) - 1 флакон - 6,0
куб.см.
8. Детерген ттвин-20, жидкий (№8) - 1 флакон - 0,6 куб.см.
9. Натрий хлористый (№9) - 1 флакон - 5,1 г
10. n-диметил-формамид (№10) - 1 флакон - 0,3 куб.см.
11. 3-амино-9-этилкарбазол (АЭК) (№11) - 1 флакон - 2,0 мг
12. Сухое обезжиренное молоко (№12) - 1 флакон - 5,0 г
Плоскодонные стерильные культуральные полистироловые планшеты 96-ти луночные 1
шт.
3. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
2.1. Принцип цитохимического (гистохимического) варианта иммуноферментного
метода (регохidasе-linked antibody assay (РlА), как разновидности иммуноферментного анализа,
заключается в размножении вируса КЧС в чувствительной культуре клеток с последующим
выявлением антигена в инфицированных клетках с помощью высокочувствительных,
специфических реагентов.
2.2. Специфический комплекс антиген-антитело в культуре инфицированных клеток
может выявляться в двух вариантах постановки ЦВИА:
а) с помощью специфических меченых антител (прямой вариант),
б) с помощью специфических антител и конъюгата антивидовых меченых антител
(непрямой вариант).
Идикатором специфического иммунокомплекса антиген-антитело, образовавшегося на
твердой фазе служит ковалентно связанный фермент (пероксидаза хрена), визуализируемый в
результате реакции фермента с хромогенным субстратом, что позволяет учитывать реакцию
под световым микроскопом или автоматическим спектрофотометром. На проведение
исследования требуется 4-5 дней.
3. ВЗЯТИЕ И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДИАГНОЭА НА КЧС
3.1. Для выявления вируса классической чумы свиней берут пробы крови, кусочки
селезенки, миндалин, лимфоузлов, грудной кости (костный мозг), почек и легких от 2-3
животных в первые 2 ч после гибели или вынужденного убоя больных или подозреваемых в
заболевании. Материалом для исследования, кроме того, могут служить вируссодержащие
инфицированные вирусом культуры при оценке сырья при производстве вакцины.
3.2. Материал отбирают асептически в стерильные флаконы, закрывают резиновыми
пробками, флаконы обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором. Отобранный
материал консервируют растворами антибиотиков. На флаконы наклеивают этикетки с
указанием вида животного, наименования материала и его количества, времени получения и
почтового адреса отправителя и замораживают.
3.3. Поступившие на исследование материалы освобождают от консервирующей
жидкости 2-З-х кратным отмыванием в стерильном ФБР с антибиотиками, взвешивают,
измельчают сначала ножницами, а затем в гомогенизаторе, смешивая 1:5 или 1:10 с
питательной средой для культивирования клеток с добавлением антибиотиков амфотерицина Б
6 мкг/мл, канамицина 600 мкг/мл, неомицина с бацитрацином 150 мкг/мл. Полученную 10-20
% суспензию центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, собирают надосадочную жидкость,
которая служит исследуемым материалом для выделения вируса.
Суспензии инфицированных вирусом клеточных культур и аттенуированных
культуральных вакцин исследуют в цельном виде.
Культура клеток, используемая для репродукции вируса, должна быть проверена на
отсутствие контаминаций вирусом диареи крупного рогатого скота. Сыворотку, используемую
для выращивания культур клеток, также проверяют на отсутствие антигена и антител вируса
диареи крупного рогатого скота.
4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ
Проведению исследования испытуемого материала методом цитохимического варианта
иммуноферментного анализа (ЦВИА) предшествует приготовление рабочих растворов
реагентов.
4.1. Готовят фиксирующий раствор ( в комплект не входит) для фиксации монослоя
клеток после инкубации ( в работе используют один из ниже перечисленных вариантов
фиксирующего раствора №№ 1-4);
№ 1 СН3 СОСН - 300 куб.см - ацетон
ФБР - куб.700 см
БСА - 200 мг - бычий сывороточный альбумин.
№ 2 С2Н50Н - этанол абсолютный
№ 3 (ехtemp.) НСО(СН)chО - 0,025 куб.см - глутаровый альдегид
ФБР - до 100 куб.см
№ 4 4% р-р параформальдегида на ФБР.
4.2. Содержимое флакона № 2 (лиофилизированный атенуированный вирус КЧС,
штамм «ЛК-ВНИИВВиМ») следует растворить в 1 куб.см ростовой среды и приготовить
рабочее разведение 10О-3ОО ТЦД (довести содержимое флакона до 100 куб.см ростовой
средой).
4.3 .Содержимое ампул с положительным (положительный контроль №3) и
отрицательными иммуноглобулинами свиньи к вирусу КЧС (отрицательный контроль
№4) растворяют в 0,2 куб.см культуральной среды.
4.4. Содержимое флакона №7 необходимо растворить в 600 мл бидистиллированной
воды. В полученный раствор добавить из флакона №9 хлористый натрий и из флакона №8
Твин-20, получаем раствор ФБР-Твин.
4.5. В отдельную емкость отобрать 100 куб.см раствора ФБР-Твин и растворить в этом
объеме буфера взятое из флакона №12 сухое молоко. Полученный блокирующий раствор
(ФБР-Твин-Молоко) используется для блокирования планшетов после фиксации и для
приготовления разведений лиофилизированного иммуноглобулина кролика (сыворотки),
специфического к вирусу КЧС (№1), антикроличьего конъюгата (№5) в разведении,
указанном на этикетках. Оставшиеся 500 куб.см раствора ФБР-Твин используют для отмывки
полистироловых планшетов.
4.6. Субстрат-индикаторный раствор: содержимое флакона № 11 (АЭК) растворяют в
содержимом флакона № 10. Полученный матричный раствор можно приготовить заранее
и хранить в темноте при комнатной температуре. Перед использованием смешать О,3 куб.см
матричного раствора с 5 куб.см 0,05 М ацетатного буфера рН 5,0 (*№6) и добавить 0,006 куб.см
н20 ( в набор не входит). Приготовленный раствор АЭК должен быть прозрачным, желто-
коричневого цвета, его необходимо защищать от прямого источника света (лучше
использовать флакон из темного стекла).
5. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ
5.1. Выделение (титрация) вируса КЧС из патматериала.
5.1.1. Готовят 100-кратный концентрат раствора антибиотиков и глутамина. Глутамин
(2,92 г) растворяют в 50 куб.см дистиллированной воды (раствор А) и стерилизуют
фильтрацией. Антибиотики: пенициллин 10 МЕ, стрептомицин - 1 г, микостатин 5х10
Е, полимиксин В 15х1- Е и канамицин - 1г, растворяют в 5-10 куб.см стерильной
дистиллированной воды (раствор В). Растворы А и В смешивают и доводят стерильной
дистиллированной водой до 100 см, хранят до использования в аликвотах по 1 куб.см при
минус 20 гр.С.
5.1.2. В стерильных условиях отрезают 1-2 миндалины или селезенки, добавляют
небольшое количество стерильного стеклянного песка с культуральной средой и
тщательно гомогенизируют в стерильной ступке или стеклянном гомогенизаторе. Из
гомогената готовят 20% (вес/объем) суспензию на культуральной среде Игла МЕМ,
добавляют 1 куб.см смеси глутамина с антибиотиками на каждые 10 куб.см суспензии
гомогената ткани и инкубируют при комнатной температуре 1 ч.
5.1.3. Суспензию осветляют низкоскоростным центрифугированием при 3000-6000 об/мин
15 мин. В работе используют супернатант.
5.1.4.Монослой культуры клеток РК-15 трипсинизируют, суспензию клеток при 800-1000
об/мин 10 мин и ресуспендируют в ростовой среде (Игла МЕМ, 5-10% фетальной
сыворотки, свободной от антител к вирусу диареи крупного рогатого скота 0,2 куб.см смеси
антибиотиков с глутамином на 10 см клеточной суспензии) до концентрации клеток
2х10 кл/см.
5.1.5. Смешивают 1 часть супернатанта (п.5.1.3) и 9 частей суспензии клеток (п. 5.1.4.) и
вносят в лунки 96-луночного планшета по 0,1-0,2 куб.см в лунку.
5.1.6. При титрации вируса, в отдельной стерильной посуде готовят серийные разведения
вируса на среде, используемой для культивирования клеток, без сыворотки с
антибиотиками. Как минимум готовят 6-8 последовательных разведений .
Кратность и объем разведения могут варьировать в зависимости от поставленной задачи и
объема исследуемого материала (количества образцов для тестирования). При кратности
разведения 1:2 шаг составляет 0,3 ig, 1 : 3 - 0,4 lg, 1: 4 - 0,6 lg, 1:5 - 0,7 lg.
Подготовленные разведения вируса переносят многоканальной пипеткой с 2-мя
наконечниками, не меняя наконечников, начиная с наивысшего разведения, в культуральные
планшеты по 0,05 куб.см в лунку.
5.1.7. Готовят суспензию клеток по п. 5.1.4. и во все лунки планшета вносят по 0,05 куб.см
6
суспензии на ростовой среде с концентрацией клеток 1,0-3,0 х 10 кл/куб.см. Планшет
закрывают пластиковой крышкой или заклеивают скетчем, осторожно перемешивают и
помещают в 002-инкубатор при 37 куб. С на 3-4 сут. Ежедневно просматривают планшеты
под инвертированным микроскопом для исключения появления дегенерации клеток или
ЦПД, вызванного контаминацией сопутствующими вирусами или бактериями. Далее по
пункту 5.3 .
5.2. Определение титра нейтрализующих антител к вирусу КЧС в реакции
нейтрализации.
5.2.1. Все сыворотки, исследуемые в реакции нейтрализации, инактивируют при 56 гр.С 30
мин.
5.2.2. Скрининг на наличие антител к вирусу К*Г: разводят сыворотки 1/10 на ростовой
среде и добавляют по 0,05 куб.см разведенной сыворотки по 2 лунки на образец.
Контрольную сыворотку свиньи (ампула №3) используют как положительный контроль
в разведении 1/200. Схема внесения образцов в лунки планшета аналогична п. 5.1.5.
Определение титра вируснейтрализирующих антител: Используют одну из
перечисленных схем разведения сывороток крови свиней.
А. «4-х точечный» - тест без контроля токсичности. На одной панели исследуют 24
сыворотки в двух разведениях 1:4 и 1:8, каждое разведение в двух повторностях. При этом все
лунки нечетных рядов оставляют свободными, а во все лунки четных рядов вносят по 0,025 куб.см
среды без сыворотки с антибиотиками. Затем в нечетные ряды вносят инактивированную
сыворотку (разведение 1:4) в объеме 0,05 куб.см, а в четные ряды эту же сыворотку в объеме 25
мкл, получая разведение 1:8. Например, образец сыворотки № 1 вносят в объеме 0,05 куб.см в
лунки А1 и В1 и в объеме 0,025 см* в лунки А2 и В2* сыворотку №2 вносят в объеме 0*05 см* в
лунки С1 и Д1 и по 0,025 куб.см в лунки С2 м Д2 и т.д. для сыворотки 3, 4 и т.д.
В. «4-х точечный» тест с контролем токсичности сыворотки. На одной панели исследуют
16 сывороток. Каждую сыворотку исследуют в двух разведениях, причем первое разведение
одновременно служит контролем токсичности сыворотки. Фактически это аналог
вышеописанной методики с дополнительным включением контроля токсичности сыворотки.
Во все лунки в колонках 1,7,10 вносят по 0,05 куб.см среды без сыворотки с антибиотиками,
лунки колонок 2,5,8,11 оставляют свободными, а в лунки колонок 3,6,9,12 вносят по 0,025 куб.см
среды. Затем готовят соответствующие разведения сыворотки. Так например, для сыворотки
№1 в лунки А1 и В1 и в лунки А2 и В2 вносят по 0,05 куб.см инактивированной сыворотки, а в
лунки АЗ.ВЗ по 0,025 куб.см , аналогично для сыворотки №2 в лунки С1 , Д1 и С2 и Д2 вносят по
50 мкл инактивированной сыворотки, а в лунки СЗ и ДЗ по 0,025 куб.см и т.д. для последующих
образцов сыворотки.
С. Более точным и воспроизводимым является следующая схема постановки реакции
нейтрализации, при которой сыворотка исследуется в 4-х разведениях. При этом панель
разбивается на 12 кластеров, которые позволяют исследовать 12 сывороток, каждое разведение
в двух повторностях. При постановке данного варианта поступают следующим образом: ряды
А и Е оставляют свободными, а во все остальные вносят по 0,05 куб.см среды без сыворотки с
антибиотиками. Для приготовления разведений в лунки рядов А и Е вносят инактивированную
сыворотку в разведении 1/4 в объеме 0,1 куб.см. Далее, используя многоканальную пипетку
методом переноса готовят серийные разведения, причем из последнего разведения (ряды В и
Н) для выравнивания объема удаляют 0,05 куб.см.
Д. При исследовании сывороток от иммунных животных после переболевания, вакцинации
целесообразно использовать «развернутую» схему постановки реакции микронейтрализации
(РМН). При «развернутой» схеме на одной панели исследуют 6 сывороток в 8 разведениях, в 2-
х повторностях.
При этом лунки ряда А оставляют свободными, а во все остальные лунки панели вносят
по 0,05 куб.см среды без сыворотки с антибиотиками. Затем в ряд А и В вносят в двух
повторностях образцы сыворотки после инактивации в объеме 0,05 куб.см и, начиная с ряда В,
используя 12-канальную пипетку, методом переноса готовят серийные разведения с шагом 2.
Из ряда Н для выравнивания объема удаляют 0,05 куб.см последнего разведения.
При подготовке серийных разведений сывороток для четырех вариантов на одной панели
размещается:
по варианту А - 24 сыворотки в 2-х разведениях без контроля токсичности,
по варианту В - 16 сывороток в 2-х разведениях с контролем токсичности,
по варианту С - 12 сывороток в 4-х разведениях,
по варианту Д - 6 сывороток в 8 разведениях.
Вместо контролей на токсичность можно ставить контроль на активность вируса.
Контрольную сыворотку свиньи (ампула №3) используют как положительный контроль в
разведении 1/200 или также подвергая титрации.
5.2.3. В лунки с разведениями сывороток добавляют суспензию вируса КЧС в рабочем
разведении, содержащем 10О-ЗОО ТЦД5о в 0,05 куб.см.
5.2.4. Смесь антиген-антитела инкубируют 1 ч при температуре 37" С.
5.2.5. Готовят суспензию клеток по п. 5.1.4. и во все лунки планшета вносят по 0,05 куб.см
6
суспензии на ростовой среде с концентрацией клеток 1,0-3,О * 10 кл/куб.см. Планшет
закрывают пластиковой крышкой или заклеивают скетчем, осторожно перемешивают
и помещают в СО2 инкубатор при 37 гр.С на 3-4 суток. Ежедневно просматривают
планшеты под инвертированным микроскопом для исключения появления дегенерации
клеток или ЦПД, вызванного контаминацией сопутствующими вирусами или
бактериями. Далее по п. 5.3.
5.3. Постановка ферментативной реакции.
5.3.1. Фиксация клеток. После окончания инкубации удаляют поддерживающую среду и в
лунки вносят ФБР для промывания монослоя клеток и после аккуратно удаляют. Вносят
по 0,1 куб.см на лунку одного из перечисленных указанных в п. 4.1. фиксирующих
растворов: абсолютный этанол (охлажденный до минус 20 гр.С) на 45 мин или
параформальдегида на 5-10 мин. Клетки, выращенные и зараженные на стекле,
фиксируют охлажденным ацетоном. Фиксирующий раствор удаляют, а монослой на
планшетах высушивают в термостате при 37 или 70 гр.С. Реакцию ставят через три часа
( период, достаточный для полного высыхания поверхности фиксированных клеток).
Планшеты можно хранить в герметически закрытых пакетах при минус 20 гр.С до
момента их использования в работе.
5.3.2. Постановка реакции.
-в лунки с фиксированными высушенными клетками добавляют по 0,1 куб.см
блокирующего раствора на 30 мин при 37 гр.С, удаляют содержимое лунок,
- вносят положительную антисыворотку кролика к антигену КЧС в рабочем разведении
на блокирующем растворе по 0,1 куб.см/лунка, планшеты инкубируют в термостате при 37 гр.
С при помешивании 30-60 мин, удаляют содержимое лунок,
- планшеты промывают 3-4- раза промывочным буфером (ФБР-Твин) комнатной
температуры, удаляют содержимое лунок,
-добавляют антикроличий пероксидазный конъюгат в рабочем разведении по 0*1 см* на
лунку, инкубируют при 37" С при помешивании 30-60 мин, удаляют содержимое лунок,
-планшеты промываются 3-4- раза промывочным буфером (ФБР-Твин) комнатной
температуры, удаляют содержимое лунок,
-добавляют свежеприготовленный субстрат 0,05 куб.см на лунку, инкубируют в термостате
при 37 гр.С 1 5-30 мин.
- когда цвет проявится достаточно интенсивно, раствор субстрата удаляют и добавляют
Н20 по О,1 куб.см на лунку.
6. УЧЕТ И ОЦЕНКА РЕАКЦИИ
6.1.Учет реакции производят под инвертированным или обычным световым
микроскопом при увеличении 5х20 и выше. Проводят оценку результатов по
контрольным лункам планшетам положительный контроль при раститровке
окрашивается в красно-коричневый цвет различной интенсивности. В лунках с
отрицательным контролем поверхность клеток остается неокрашенной или
незначительно розовеет. Цитоплазма клеток, инфицированных вирусом классической
чумы свиней, будет окрашена в темно-красный, красно-коричневый цвет, а
неинфицированные вирусом классической чумы свиней клетки будут иметь бледно-
розовый оттенок или вообще не окрасятся. При визуальном учете сравнивают окраску
содержимого лунок планшета испытуемых проб с окраской лунок контрольных
образцов. За титр испытуемого вируса или сыворотки принимают последнее
разведение, при котором наблюдают видимое окрашивание отдельных фокусов клеток
монослоя в лунках.
** Поскольку в каждую лунку с разведениями сыворотки вносят равный объем вирусной
суспензии (50 мкл), кратность разведения сыворотки УДВАИВАЕТСЯ.
При оценке результатов без раститровок испытуемых проб вируса или сывороток*
реакцию оценивают по принципу - «да» - положительная реакция, в пробе выявлены антитела
или вирус КЧС или «нет» - отрицательная реакция - в пробе отсуствует специфическая окраска
(антитела к вирусу КЧС или вирус КЧС в пробах отсутствует)
7. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
7.1. В случае отсутствия активности у отдельных компонентов набора рекламацию на
качество набора направляют в адрес предприятия-изготовителя (НПО НАРВАК, 123098
Москва, ул. Гамалеи,16), Всероссийского государственного научно-исследовательского
института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов
(ВГНКИ, 123022 Москва, Звенигородское ш., 5) и ЦНМВЛ (Москва, Косино,
Оранжерейная ул., 23) в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии
«О порядке предъявления рекламаций на ветеринарные препараты отечественного
производства и закупаемые по импорту» № 22-7/28 от 8 мая 1992 г. При наличии
невскрытых наборов с препаратами данной серии один набор направляют в ВГНКИ.
Наставление подготовлено НПО НАРВАК, одобрено Советом по ветеринарных препаратам
Департамента ветеринарии 18 июня 1998 г., протокол №3, ПВР 1.03.0759-98.