Наставление
              по применению тест-системы ПЦР 
                  для обнаружения вируса 
                 классической чумы свиней






1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

2. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ СИСТЕМЫ

3. СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

4. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ










    МИНИСТЕРСТВО                            
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                             
 РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)


ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                         УТВЕРЖДАЮ 
                                          Заместитель руководителя
                                          Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/1478 от 18 января 1999 г.             В.В.Селиверстов

НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы ПЦР 
для обнаружения вируса 
классической чумы свиней

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. НАЗНАЧЕНИЕ. Тест-система полимеразной цепной реакции (ПЦР) предназначена для 
обнаружения вируса классической чумы свиней (КЧС). С помощью данной тест-системы 
вирус КЧС может быть обнаружен в инфицированных культурах клеток и патматериале от 
больных и павших животных (кровь, селезенка, сердце, печень). Чувствительность реакции 
             3
составляет 10 ИД  . Тест-система рекомендована для определения вирулентного штамма в 
                50
крови животных через две недели после вакцинации. Один набор рассчитан на 100 анализов.

1.2. Тест-система для определения РНК вируса КЧС методом полимеразной цепной реакции 
представляет : набор для выявления вируса КЧС из 10 компонентов, набор для выделения 
РНК из 5 компонентов и набор для проведения электрофореза - из 4 компонентов.

1.2.1. Набор для выявления вируса КЧС (10 компонентов):

1. Термостабильная ДНК-полимераза ( taq-полимераза):  50 мкл раствора ДНК-
полимеразы (5000 ед/кл) - 1 пробирка.

2. Мезофильная ревертаза (amv-rt или m-mlv): 50 мкл раствора (10 ООО ед/мл) - 1 
проб.

3.   Смесь   нуклеозидтрифосфатов   (dntps):   0,75 мл   водного   раствора 
нуклеозидтрифосфатов с концентрацией 2.5 мМ каждого - 1 проб.

4. Контрольная лиофилизированная вакцина штамма ЛК-ВНИИВВиМ - 4амп 1 куб.см 
вещества.

5. Смесь праймеров №1 1: 0,2 мл водного раствора олигонуклеотида №1 с 
концентрацией 10 пмоль/мкл - 1 проб.

6. Смесь праймеров №2 : 0,2 мл водного раствора олигонуклеотида №2 с 
концентрацией 10 пмоль/мкл - 1 проб.

7. 10-кратный реакционный буфер (10 * буфер): 0,8 мл - 1 проб.

8. 5-кратный реакционный буфер (5 * буфер): 0,5 мл - 1 проб.

9. Деионизованная вода: 5 мл воды, деионизованной системой milli q фирмы millipore 
или обработанной диэтилпирокарбонатом - 5 фл.

10. Вазелиновое масло: 8 мл - 1фл.

i.2. Набор для выделения РНК ( 5 компонентов)

ii. Раствор №1: 110 мл - 1 фл.

12. Раствор №2: 40 мл - 1 фл.

13. Раствор №3: 40 мл - 1 фл.

14. Раствор №4: 20 мл - 1фл.

15. Сорбент :4 мл водной суспензии сорбента - 1 пробирка.

1. 3. Набор для проведения электрофореза ( 4 компонента) 
( на 10 гелей по 10 образцов).

16. Агароза - 10г- 1 проборка.

17. 10 * ТАЕ буфер : 100 мл раствора - 1 проб.

18. Раствор бромистого этидия 10 мг/мл: 300 мкл раствора - 1 проб.

19.Буфер для нанесения образца: 0,3 мл раствора - 1 проб.

В каждый пакет с тест-системой вкладывается наставление по применению.

1.4. Флаконы и пробирки с компонентами укладывают в коробки с наименованием тест-системы. 
На пробирках и флаконах с каждым компонентом должна быть этикетка с указанием краткого 
названия и номера компонента.

1.5. На каждую коробку набора наклеивают этикетку с указанием: предприятия-изготовителя и 
товарного знака, наименования тест-системы и каждого набора, номера серии и контроля, даты 
изготовления, срока годности, условий хранения, обозначения номера ТУ.

1.6. Хранение набора для выявления вируса КЧС - при температуре минус 20 гр.С (не ниже), не 
допуская замораживания фермента, хранение наборов для выделения РНК и проведения 
электрофореза - при температуре 4 гр.С Срок годности тест-системы - 6 мес.

2. ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ СИСТЕМЫ

2.1. В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой 
пробе при температуре 94 гр.С, гибридизации (отжига) с исследуемой ДНК специфических 
олигонуклеотидных затравок (праймеров) при температуре ЬО^С и синтез с них комплементарных 
цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С.

В результате проведения 36 циклов амплификации, концентрация синтезированного 
фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллиарды раз, что позволяет учитывать 
результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле.

3. СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

3.1 Выделение вирусной РНК:

Все манипуляции, связанные с использопанием тест-системы ПЦР, проводятся 
пипеточными дозаторами типа "Ленпппет" следующих объемов: 0-20 мкл, 20-200 мкл, 0-1000 
мкл с использованием полипропиленовых пробирок на 1,5 мл (ПО "Ленполимер") и 0,5 мл 
наконечников к пнпеточным дозаторам одноразового использования.

Для выделения вирусной РНК необходимо использовать набор для выделения РНК. 

Образцы исследуемого биологического материала (кровь, гомогенат ткани) в объеме 0,2-0,3 
мл помещают в полипропиленовые пробирки и добавляют 1,1 мл раствора №1. Инкубируют 10 
мин. при комнатном температуре при перемешивании. Пробы центрифугируют на центрифуге 
типа "Эппендорф" 5 мин при 13000 об/мин, супернатант переносят в чистые пробирки, а осадок 
отбрасывают. К супернатану добавляют 40 мкл сорбента и инкубируют при комнатной 
температуре в течение 10 мин, 1-2 раза перемешивая на вортексе. Затем центрифугируют 15 с на 
микроцентрифуге при 13000 об./мин, супернатант отбрасывают. К осадку добавляют 0,2 мл 
раствора № 2, перемешивают на вортексе и осаждают сорбент центрифугированием в течение 15 
с. Супернатант отбрасывают. Процедуру промывки осадка раствором № 2 повторяют. Дважды 
промывают осадок сорбента, используя 0,2 мл раствора №3 и один раз, используя 0,2 мл раствора 
№ 4. Пробы сушат в течение 10-15 мин при 56гр.С. оставляя пробирки открытыми. К пробам 
добавляют по 30 мкл деионнзованной воды,перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 
10-15 мин при 56°С, в закрытых пробирках. Пробы центрифугируют 1 мин. при 13000 об./мин. 
и водную фазу используют для проведения ПНР.

ВНИМАНИЕ: На всех стадиях обработки биоматериала, удаление супернатанта производить 
одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи водоструйного насоса в колбу-
ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т. п.)

3.2. Построение первой цепи кДНК (реакция обратной транскрипции).

В пробирку на 0,5 мкл добавляют 5 мкл раствора № 8, 2,5 мкл раствора №3, по 2 мкл растворов 
№5 и №6, 0,5 мкл раствора № 2,10 мкл выделенной РНК и раствор №9 до конечного объема 25 
мкл. Инкубируют при 37°С в течение 60 мин. Реакцию останавливают инкубацией 10-15 мин при 
-70°С. ( либо 5 мин при 95°С). Для последующей ПЦР используют 5 мкл полученного раствора 
ДНК.

3.3. Проведение первого раунда полимеразной цепной реакции.

Идентификация вируса КЧС проводится с использованием полимеразной цепной реакции 
(ПЦР) после получения из вирусной РНК фрагментов кДНК. В основе метода лежит 
многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 94°С, 
гибридизации (отжига) с исследуемой ДНК специфических олигонуклеотидных затравок 
(праймеров) при температуре 60°С и синтез с них комплементарных цепей ДНК с помощью 
термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72°С.

В результате проведения 36 циклов амплификации, концентрация синтезированного фрагмента 
в исследуемой пробе увеличивается в миллиарды раз, что позволяет учитывать результаты 
анализа с помощью электрофореза в агарозном геле.

В пробирку, объёмом 1,5 мл вносят следующие компоненты набора для выявления вируса КЧС :

10 * буфер              - 4 мкл 
dntps                   - 2,5 мкл 
смесь праймеров №1      - 1 мкл 
ДНК-полимераза          - 0,25 мкл 
деионизованная вода     - до 25 мкл 
кДНК                    - 5 мкл

Перемешивают, все капли собирают центрифугированием в течение 5-10 сек. 
На поверхность водной фазы осторожно наносят 40 мкл ( 2-3 капли ) вазелинового масла. 
Пробы амплифицируют на амплификаторе . 
Температурный режим :

94°С - 2 мин
60°С - 1 мин       1 цикл
72°С - 2 мин

94°С - 0.5 мин
60°С - 0.5 мин     23 цикла
72°С - 0.5 мин

94°С - 2 мин 
60°С - 1 мин       1цикл
72°С - 5 мин 

3.4 Проведение второго раунда полимеразной цепной реакции

Все процедуры проводят так же как описано в п. 2.3 со следующими изменениями:

- используют смесь праймеров №2
- вместо кДНК используют продукт реакции ПЦР первого раунда-также 5 мкл.

3.5. Контроли - положительный и отрицательный:

В каждой серии анализов ставят два контрольных образца: k+ (положительный) - РНК, 
полученная из вакцины, входящей в состав тест-системы, по стандартной методике 
выделения и К- (отрицательный) - деионизованная вода (раствор 11). Смеси для 
контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемого образца.

При отсутствии расчетного фрагмента (307 п. н.) отобрать 5 мкл реакционной смеси и 
поставить повторную амплификацию (реамплификацию) с праймерами №2 и №3 ( растворы 
6 и 7). Состав реакционной смеси и режим амплификации вышеописанные. Соотношение 
циклов амплификации и реамплификации 25:25.

При точном соблюдении наставления по применению анализ занимает от 8 до 24 ч ( в 
зависимости от условий выделения).

4 . УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ

Результаты исследования учитываются путем анализа продуктов амплификации 
исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле.

4. 1. Приготовление буфера для электрофореза.

Для приготовления 1 л буфера для электрофореза навеску 4.04 г Триса растворяют в 
200 мл дистиллированной воды, добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0.5 М 
раствора ЭДТА рН 8.0 и доводят объём буфера до 1000 мл дистиллированной водой. В 
случае использования набора для проведения электрофореза к 100 мл 10 * ТАЕ буфера 
добавить 900 мл дистиллированной воды и бромистого этидия до концентрации 0.5 мкг/мл.

4. 2. Приготовление агарозного геля.

К 2% суспензии агарозы в буфере для электрофореза добавляют бромистый этидий до 
концентрации 0.5 мкг/ мл, доводят до кипения и охлаждают до 45°С. Заливают в 
специальную форму с гребёнкой и дают затвердеть. Гребёнку осторожно вынимают и форму 
с агарозой переносят в аппарат для горизонтального электрофореза (ПГ-9 "Диа - М") и 
погружают в буфер.

4. 3. Электрофорез продуктов амплификации.

В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят 
аккуратно под масло 3 мкл раствора 24 ( 0.25% раствор бромфенолового синего в 50% 
глицерине), перемешивают наконечником для пипеточных дозаторов и 10 мкл полученного 
образца вносят в лунки агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребёнки.

Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/ см длины геля в течение 60 мин. За 
это время краситель успевает пройти не менее половины геля.

4. 4. Учет результатов электрофореза.

Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 
нм на приборе "Трансиллюминатор", предварительно агарозный гель выдерживают в 
растворе бромистого этидия ( 0.05 мкг/мл) в течение 20 мин для окрашивания ДНК в геле.

После окрашивания результаты реакции выявляются в виде светящихся красноватых 
полос. Положительными ( т. е. содержащими вирус КЧС ) считаются пробы, в которых 
полосы в геле располагаются точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса
положительного контроля. В отрицательном контроле не должно выявляться никаких
полос.

Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких 
полос или они не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе.

Документирование полученных результатов проводят на фотопленке (Микрат - 300) 
аппаратом типа "Зенит" с оранжевым светофильтром.

4.5. Необходимые условия успешного проведения анализа.

4.5. 1. Строгое соблюдение условий хранения компонентов тест-системы.

4.5.2. Разовое (однократное ) использование наконечников и пробирок. Ранее 
использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя!

4.5.3. При составлении смеси для амплификации вначале готовить отрицательный 
контроль, а последним - положительный контроль.

4.5.4. Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или 
тщательно обработана хромпиком и отмыта.

5. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

Рекламации на качество данной тест-системы в соответствии с указанием Главного 
управления ветеринарии № 22-7/28 от 8 мая 1992 г. «О порядке предъявления рекламаций на 
ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту» направляют предприятию-
изготовителю (123098 Москва, ул. Гамалеи, 16, НПО НАРВАК), во Всероссийский 
государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации 
ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022 Москва, Звенигородское ш., 5 и ЦНМВЛ 
(Москва, Косино, Оранжерейная, 23). При наличии невскрытых наборов данной серии один набор 
направляют в ВГНКИ.

Наставление разработано НПО НАРВАК, одобрено Советом по ветеринарным препаратам 
Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ 18.06.1998 г., протокол № 3, № ПВРт1.03.0754-
98.

Начальник отдела ветеринарно-санитарной 
экспертизы и лабораторной работы                              В.И.Белоусов