Наставление
по применению тест-системы
ПЦР для идентификации
бактерий вида bacillus anthracis
1. Общие положения
2. Принцип действия тест-системы
3. Порядок применения
- проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР);
- проведение реакции амплификации ДНК, выделенной из исследуемого материала;
- учет результатов амплификации;
- необходимые условия успешного проведения анализа;
4. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/1477 от 18 января 1999 г. В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению тест-системы
ПЦР для идентификации
бактерий вида bacillus anthracis
1. Общие положения
1.1. Тест-система полимеразной цепной реакции (ПЦР) предназначена для
выявления и идентификации бактерий вида bacillus anthracis, содержащих
ген капсулообразования - Сар В. С помощью данной тест-системы,
капсулообразующие бактерии bacillus anthracis (в вегетативной форме) в
концентрации 103 кл/мл могут быть обнаружены в микробиологических
культурах, жидких пробах из объектов окружающей среды и в концентрации
2 * 103 кл/ г ткани в патматериале от больных и павших животных (кровь,
селезенка, сердце, печень).
1.2.Тест-система представляет собой набор для проведения ПЦР из 10
компонентов и набор для проведения электрофореза из 4 компонентов .
1.3. Компоненты набора для проведения ПЦР расфасовывают в
стерильные пробирки типа "Эппендорф" или флаконы и пробирки
вместимостью 5 мл с завинчивающейся крышкой фирмы "costar", США, № МА
02140.
1.4. Компоненты набора для проведения электрофореза расфасовывают в
стерильные пробирки типа "Эппендорф" или флаконы и пробирки
вместимостью 50 мл с завинчивающейся крышкой фирмы "costar",
Нидерланды, кат. № 6755 или фирмы "greiner".
Набор для проведения ПЦР включает:
1. Термостабильная ДНК-полимераза (taq-полимераза) - 1 пробирка, 50
мкл раствора (5 ед./мкл)
2. Смесь нуклеотидтрифосфатов (dntps) - 1 пробирка, 0,25 мл водного
раствора с концентрацией 2,5 мМ каждого.
3. Контрольная ДНК плазм иды рХ02 или ее амплификат -1 пробирка с
0,1 мл ДНК или амплификата.
4. Праймер №1-1 пробирка с 0,1 мл водного раствора олигонуклеотида
pwarg в концентрации 20 пмоль/мкл.
5. Праймер №2 i пробирка с oj мл водного раствора олигонуклеотида
pwarc в концентрации 20 пмоль/мкл.
6. 10-кратный реакционный буфер для ПЦР - 1 пробирка, 0,5 мл
стерильного раствора
7. Деионизоваппая вода- 1 флакон с 4,5 мл воды
8. Вазелиновое масло - 1 флакон с 5 мл вазелинового масла
насыщенного подои.
9. Буфер пробоподготовки - 1 флакон с 2 мл хелатирующего реагента в
инактнвнрующем буфере.
10. Буфер для гомогенизации - 1 флакон с 50 мл раствора.
Набор для проведения электрофореза включает:
11. Агароза - 1 флакон с 10 г порошка.
12. 10 * ТАЕ буфер - 1 флакон с 100 мл раствора.
13. Раствор бромистого этидия 0,5 мкт/мл - 1 пробирка с 0,1 мл раствора
14. Буфер для нанесения образца - 1 пробирка с 0,3 мл раствора
1.5 На пробирках и флаконах с каждым компонентом должна быть
этикетка с указанием краткого названия, объема и номера компонента. Каждая
тест-система снабжается наставлением по применению
1.6. Флаконы и пробирки с компонентами упаковывают в
полиэтиленовые пакеты с наименованием тест-системы и каждого набора. На
каждый пакет с компонентами наборов тест-системы наклеивают этикетку с
указанием: предприятия-изготовителя и товарного знака, наименования тест-
системы и набора, номера серии и номера контроля, даты изготовления, срока
годности, условии хранения, обозначения настоящих ТУ.
1.7.Транспортирование тест-системы проводится при температуре от 0°С
до минус 20 гр.С. Хранить набор компонентов для ПЦР необходимо при
температуре от минус 10 до минус 20 гр.С, а набор компонентов для
электрофореза при 4 гр.С. Срок годности тест-системы - 6 мес.
1.8. Одна тест-система рассчитана на 100 анализов.
При точном соблюдении наставления по применению анализ занимает 6 -
8 часов.
2. Принцип действия тест-системы.
2.1. Идентофикаця бактерий вида bacillus anthracis (возбудителя
сибирской язвы), содержащих ген капсулообразования - cap В проводится с
использованием полпмеразной цепной реакции (ПЦР) после амплификации
фрагментов ДНК В.anthracis. В основе метода лежит многократное повторение
циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 94гр.С,
гибридизации (отжига) с исследуемой ДНК специфических олигонуклеотидных
затравок ( праймеров ) при температуре 50 гр.С и синтез с них комплементарных
цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре
72 гр.С.
В результате проведения 30 циклов амплификации , концентрация
синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллион
раз, что позволяет легко учитывать результаты анализа с помощью
электрофореза в агарозном геле.
3. Порядок применения
3.1. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
3.1.1. Подготовка образцов проводится в боксе, в условиях работы с
микроорганизмами ii группы опасности. Все операции проводятся
стерильными инструментами с использованием одноразовой пластиковой
посуды и стерильной, химически чистой посуды.
3.1.2. Жидкие пробы ( вода, суспензии бактерий, смывы) в объёме 1 мл
помещают в полипропиленовые пробирки объёмом 1,5 мл и центрифугируют 5
мин. на центрифуге типа "eppendorf" при 10000 об/мин. После
центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в
100 мкл буфера для пробоподготовки, прогревают 20 мин при 100°С. Затем
центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин. В реакцию берут 5 мкл супернатанта.
3.1.3. Пробы патматериалов (кусочки селезенки, лимфоузлов, сердца 0,5 г)
больных или павших животных гомогенизируют в 0,5 мл раствора №10 с
помощью гомогенизатора Поттера (стекло/стекло, объем 2,5 - 5 мл). К
гомогенатам тканей (200 мкл) добавляют по 200 мкл буфера для
пробоподготовки ( раствора №9) и прогревают 20 мин при 100°С. Затем
центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин. В реакцию берут 5 мкл супернатанта.
3.1.4. Пробы крови больных или павших животных в объеме 200 мкл
смешивают с 200 мкл буфера для пробоподготовки (раствор №9),
прогревают 20 мин при 100°С. Затем центрифугируют 5 мин при 10000
об/мин. В реакцию берут 5 мкл супернатанта, содержащего выделенную
ДНК.
3.2. Проведение реакции амплификации ДНК, выделенной из исследуемого
материала.
3.2.1. В пробирку объёмом 1,5 мл вносят следующие компоненты набора для
ПЦР:
деионизованная вода - до конечного объема 25 мкл
10 * буфер - 2,5 мкл
dntps - 2 мкл
праймер 1 - 0,5 мкл
праймер 2 - 0,5 мкл
ДНК - 5 мкл
ДНК-полимераза - 0,25 мкл
Встряхивают пробирку на смесителе, капли осаждают центрифугированием
в течение 5-10 сек. при 13000 об. / мин
На поверхность водной фазы осторожно наносят 50 мкл (3 капли ) раствора
№8 (вазелиновое масло).
Переносят пробирку в амплификатор. Температурный режим :
94°С - 2 мин
50°С - 1 мин 1 цикл
72°С - 2 мин
94°С - 0,5 мин
50°С - 0,5 мин 28 циклов
72°С - 0,5 мин
94°С - 2 мин
50°С - 1 мин 1 цмкл
72°С - 5 мин
3.2.2. Контроли - положительный и отрицательный
В каждой серии анализов ставят два контрольных образца: К+
(положительный) - раствор №3 (плазмидная ДНК, входящая в состав тест-
системы) и К- (отрицательный) - раствор №7 (деионизованная вода). Смеси для
контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемого
образца.
В случае неоднозначных результатов амплификации, проводят
реамплификацию по приведенной выше прописи. В качестве матрицы (ДНК)
используют 5 мкл амплификационной смеси.
3.3. Учет результатов амплификации.
Результаты исследования учитываются путем анализа продуктов
амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле.
3.3.1. Приготовление буфера для электрофореза.
Для приготовления 1 л буфера для электрофореза навеску 4,04 г Триса
(гидроксиламинометана) растворяют в 200 мл дистиллированной воды,
добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА рН
8,0 и доводят объём буфера до 1000 мл дистиллированной водой. В случае
использования набора для проведения электрофореза, к 100 мл 10 * ТАЕ буфера
добавляют 900 мл дистиллированной воды.
3.3.2. Приготовление агарозного геля.
2%-ную суспензию агарозы в буфере для электрофореза доводят до кипения и
охлаждают до 45°С. Заливают в специальную форму с гребёнкой и дают
затвердеть. Гребёнку осторожно вынимают, форму с агарозой переносят в
аппарат для горизонтального электрофореза (ПГ-9 "Диа - М") и погружают в
буфер.
3.3.3. Электрофорез продуктов амплификации.
В пробирки с исследуемыми образцами, после завершения амплификации
вносят аккуратно под масло 3 мкл раствора №14 (0,25%-ный раствор
бромфенолового синего в 50%-ном глицерине), перемешивают наконечником
для пипеточных дозаторов и 10 мкл полученного образца вносят в лунки
агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребёнки.
Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/на см длины геля, в течение
60 мин. За это время краситель успевает пройти не менее половины геля.
3.3.4. Учет результатов электрофореза.
Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной
волны 254 нм на приборе "Трансиллюминатор", 2%-ную суспензию агарозы в
буфере для электрофореза доводят до кипения и охлаждают до 45°С и
добавляют бромистый этидий до концентрации 0,5 мкг/мл Заливают в
специальную форму с гребёнкой и дают затвердеть. Гребёнку осторожно
вынимают, форму с агарозой переносят в аппарат для горизонтального
электрофореза (ПГ-9 "Диа - М") и погружают в буфер.
Результаты реакции выявляются в виде светящихся полос.
Положительными ( содержащими ДНК капсульного штамма bacillus anthracis )
считаются пробы, в которых полосы в геле располагаются точно на таком же
расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. В
отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос.
Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено
никаких полос , или они не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной
пробе (т, е. располагаются на другом расстоянии от старта).
Документирование полученных результатов проводят на фотопленке
(Микрат - 300) аппаратом типа "Зенит" с оранжевым светофильтром.
3.4. Необходимые условия успешного проведения анализа.
Строгое соблюдение условий хранения компонентов тест-системы.
Разовое (однократное ) использование наконечников и пробирок. Ранее
использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя!
При составлении смеси для амплификации вначале готовить
отрицательный контроль, а последним - положительный контроль.
Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или
тщательно обработана хромпиком и отмыта.
4. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ
Рекламации на качество данной тест-системы в соответствии с указанием
Главного управления ветеринарии № 22-7/28 от 8 мая 1992 г. «О порядке
предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и
закупаемые по импорту» направляют предприятию-изготовителю (123098
Москва, ул. Гамалеи, 16, НПО НАРВАК), во Всероссийский государственный
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации
ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022 Москва, Звенигородское
ш., 5 и ЦНПВЛ (Москва, Косино, Оранжерейная, 23). При наличии невскрытых
тест-систем данной серии одну тест-систему направляют в ВГНКИ.
Наставление разработано НПО НАРВАК, одобрено Советом по
ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ
18.06.1998 г., протокол № 3, №________.
Начальник отдела ветеринарно-санитарной экспертизы и лабораторной работы
В.И.Белоусов