Наставление 
                по применению тест-системы 
                  ПЦР для идентификации 
             бактерий вида bacillus anthracis


1. Общие положения

2. Принцип действия тест-системы

3. Порядок применения
- проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР);
- проведение реакции амплификации ДНК, выделенной из исследуемого материала;
- учет результатов амплификации;
- необходимые условия успешного проведения анализа;

4. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ




    МИНИСТЕРСТВО                            
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                             
 РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                         УТВЕРЖДАЮ 
                                          Заместитель руководителя
                                          Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/1477 от 18 января 1999 г.             В.В.Селиверстов

НАСТАВЛЕНИЕ 
по применению тест-системы 
ПЦР для идентификации 
бактерий вида bacillus anthracis

1. Общие положения

1.1. Тест-система полимеразной цепной реакции (ПЦР) предназначена для 
выявления и идентификации бактерий вида bacillus anthracis, содержащих 
ген капсулообразования - Сар В. С помощью данной тест-системы, 
капсулообразующие бактерии bacillus anthracis (в вегетативной форме) в 
концентрации 103 кл/мл могут быть обнаружены в микробиологических 
культурах, жидких пробах из объектов окружающей среды и в концентрации 
2 * 103 кл/ г ткани в патматериале от больных и павших животных (кровь, 
селезенка, сердце, печень).

1.2.Тест-система представляет собой набор для проведения ПЦР из 10 
компонентов и набор для проведения электрофореза из 4 компонентов .

1.3. Компоненты набора для проведения ПЦР расфасовывают   в 
стерильные пробирки типа "Эппендорф"    или флаконы   и пробирки 
вместимостью 5 мл с завинчивающейся крышкой фирмы "costar", США, № МА 
02140.

1.4. Компоненты набора для проведения электрофореза расфасовывают в 
стерильные пробирки типа "Эппендорф"   или флаконы и пробирки 
вместимостью 50 мл с завинчивающейся крышкой фирмы "costar", 
Нидерланды, кат. № 6755 или фирмы "greiner".

Набор для проведения ПЦР включает:

1. Термостабильная ДНК-полимераза (taq-полимераза) - 1 пробирка, 50 
мкл раствора (5 ед./мкл)

2. Смесь нуклеотидтрифосфатов (dntps) - 1 пробирка, 0,25 мл водного 
раствора с концентрацией 2,5 мМ каждого.

3. Контрольная ДНК плазм иды рХ02 или ее амплификат -1 пробирка с 
0,1 мл ДНК или амплификата.

4. Праймер №1-1 пробирка с 0,1 мл водного раствора олигонуклеотида 
pwarg в концентрации 20 пмоль/мкл.

5. Праймер №2 i пробирка с oj мл водного раствора олигонуклеотида 
pwarc в концентрации 20 пмоль/мкл.

6. 10-кратный реакционный буфер для ПЦР  - 1 пробирка, 0,5 мл 
стерильного раствора

7. Деионизоваппая вода- 1 флакон с 4,5 мл воды

8. Вазелиновое масло - 1 флакон с 5 мл вазелинового масла
насыщенного подои.

9. Буфер пробоподготовки - 1 флакон с 2 мл хелатирующего реагента в 
инактнвнрующем буфере.

10. Буфер для гомогенизации - 1 флакон с 50 мл раствора.

Набор для проведения электрофореза включает:

11. Агароза - 1 флакон с 10 г порошка. 

12. 10 * ТАЕ буфер - 1 флакон с 100 мл раствора.

13. Раствор бромистого этидия 0,5 мкт/мл - 1 пробирка с 0,1 мл раствора

14. Буфер для нанесения образца - 1 пробирка с 0,3 мл раствора

1.5 На пробирках и флаконах с каждым компонентом должна быть 
этикетка с указанием краткого названия, объема и номера компонента. Каждая 
тест-система снабжается наставлением по применению

1.6.   Флаконы и пробирки с компонентами упаковывают    в 
полиэтиленовые пакеты с наименованием тест-системы и каждого набора. На 
каждый пакет с компонентами наборов тест-системы наклеивают  этикетку с 
указанием: предприятия-изготовителя и товарного знака, наименования тест-
системы и набора, номера серии и номера контроля, даты изготовления, срока 
годности, условии хранения, обозначения настоящих ТУ.

1.7.Транспортирование тест-системы проводится при температуре от 0°С 
до минус 20 гр.С. Хранить набор компонентов для ПЦР необходимо при 
температуре от минус 10 до минус 20 гр.С, а набор компонентов для 
электрофореза при 4 гр.С. Срок годности тест-системы - 6 мес.

1.8. Одна тест-система рассчитана на 100 анализов.

При точном соблюдении наставления по применению анализ занимает 6 -
8 часов.

2. Принцип действия тест-системы.

2.1.  Идентофикаця бактерий вида bacillus   anthracis (возбудителя 
сибирской язвы), содержащих ген капсулообразования - cap В проводится с 
использованием полпмеразной цепной реакции (ПЦР) после амплификации 
фрагментов ДНК В.anthracis. В основе метода лежит многократное повторение 
циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе при температуре 94гр.С, 
гибридизации (отжига) с исследуемой ДНК специфических олигонуклеотидных 
затравок ( праймеров ) при температуре 50 гр.С и синтез с них комплементарных 
цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 
72 гр.С.

В результате проведения 30 циклов амплификации , концентрация 
синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллион 
раз, что позволяет легко учитывать результаты анализа с помощью 
электрофореза в агарозном геле.

3. Порядок применения

3.1. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

3.1.1. Подготовка образцов проводится в  боксе, в условиях работы с 
микроорганизмами ii группы опасности. Все операции проводятся 
стерильными инструментами с использованием одноразовой пластиковой 
посуды и стерильной, химически чистой посуды.

3.1.2. Жидкие пробы ( вода, суспензии бактерий, смывы) в объёме 1 мл 
помещают в полипропиленовые пробирки объёмом 1,5 мл и центрифугируют 5 
мин. на центрифуге типа "eppendorf"    при 10000 об/мин. После 
центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в 
100 мкл буфера для пробоподготовки, прогревают 20 мин при 100°С. Затем 
центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин. В реакцию берут 5 мкл супернатанта.

3.1.3. Пробы патматериалов (кусочки селезенки, лимфоузлов, сердца 0,5 г) 
больных или павших животных гомогенизируют в 0,5 мл раствора №10 с 
помощью гомогенизатора Поттера (стекло/стекло, объем 2,5 - 5 мл). К 
гомогенатам тканей   (200 мкл) добавляют по 200 мкл буфера для 
пробоподготовки ( раствора №9) и прогревают 20 мин при 100°С. Затем 
центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин. В реакцию берут 5 мкл супернатанта.

3.1.4. Пробы крови больных или павших животных  в объеме 200 мкл 
смешивают с 200 мкл буфера для пробоподготовки (раствор №9), 
прогревают 20 мин при 100°С. Затем центрифугируют 5 мин при 10000 
об/мин. В реакцию берут 5 мкл супернатанта, содержащего выделенную 
ДНК.

3.2. Проведение реакции амплификации ДНК, выделенной из исследуемого
материала.

3.2.1. В пробирку объёмом 1,5 мл вносят следующие компоненты набора для 
ПЦР:

деионизованная вода - до конечного объема 25 мкл 
10 * буфер           - 2,5 мкл 
dntps                - 2 мкл 
праймер 1            - 0,5 мкл 
праймер 2            - 0,5 мкл 
ДНК                  - 5 мкл 
ДНК-полимераза       - 0,25 мкл

Встряхивают пробирку на смесителе, капли осаждают центрифугированием 
в течение 5-10 сек. при 13000 об. / мин

На поверхность водной фазы осторожно наносят 50 мкл (3 капли ) раствора 
№8 (вазелиновое масло).

Переносят пробирку в амплификатор. Температурный режим :

94°С - 2 мин
50°С - 1 мин       1 цикл
72°С - 2 мин

94°С - 0,5 мин
50°С - 0,5 мин     28 циклов
72°С - 0,5 мин

94°С - 2 мин 
50°С - 1 мин        1 цмкл
72°С - 5 мин

3.2.2. Контроли - положительный и отрицательный

В каждой серии анализов ставят два контрольных образца: К+
(положительный) - раствор №3 (плазмидная ДНК, входящая в состав тест-
системы) и К- (отрицательный) - раствор №7 (деионизованная вода). Смеси для 
контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемого 
образца.

В   случае   неоднозначных   результатов   амплификации,   проводят 
реамплификацию по приведенной выше прописи. В качестве матрицы (ДНК) 
используют 5 мкл амплификационной смеси.

3.3. Учет результатов амплификации.

Результаты  исследования  учитываются  путем  анализа  продуктов 
амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в агарозном геле.

3.3.1. Приготовление буфера для электрофореза. 
Для приготовления 1 л буфера для электрофореза навеску 4,04 г Триса 
(гидроксиламинометана) растворяют в 200 мл дистиллированной воды, 
добавляют 1,14 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл 0,5 М раствора ЭДТА рН 
8,0 и доводят объём буфера до 1000 мл дистиллированной водой. В случае 
использования набора для проведения электрофореза, к 100 мл 10 * ТАЕ буфера 
добавляют 900 мл дистиллированной воды.

3.3.2. Приготовление агарозного геля.

2%-ную суспензию агарозы в буфере для электрофореза доводят до кипения и 
охлаждают до 45°С. Заливают в специальную форму с гребёнкой и дают 
затвердеть. Гребёнку осторожно вынимают, форму с агарозой переносят в 
аппарат для горизонтального электрофореза (ПГ-9 "Диа - М") и погружают в 
буфер.

3.3.3. Электрофорез продуктов амплификации. 
В пробирки с исследуемыми образцами, после завершения амплификации 
вносят аккуратно под масло 3 мкл раствора №14 (0,25%-ный раствор 
бромфенолового синего в 50%-ном глицерине), перемешивают наконечником 
для пипеточных дозаторов и 10 мкл полученного образца вносят в лунки 
агарозного геля, образовавшиеся от зубцов гребёнки.

Электрофорез проводят при напряжении 8 вольт/на см длины геля, в течение 
60 мин. За это время краситель успевает пройти не менее половины геля.

3.3.4. Учет результатов электрофореза.

Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной 
волны 254 нм на приборе "Трансиллюминатор", 2%-ную суспензию агарозы в 
буфере для электрофореза доводят до кипения и охлаждают до 45°С и 
добавляют бромистый этидий до концентрации 0,5 мкг/мл Заливают в
специальную форму с гребёнкой и дают затвердеть. Гребёнку осторожно 
вынимают, форму с агарозой переносят в аппарат для горизонтального 
электрофореза (ПГ-9 "Диа - М") и погружают в буфер.

Результаты  реакции   выявляются   в   виде  светящихся  полос. 
Положительными ( содержащими ДНК капсульного штамма bacillus anthracis ) 
считаются пробы, в которых полосы в геле располагаются точно на таком же 
расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. В 
отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос.

Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено 
никаких полос , или они не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной 
пробе (т, е. располагаются на другом расстоянии от старта).

Документирование полученных результатов проводят на фотопленке 
(Микрат - 300) аппаратом типа "Зенит" с оранжевым светофильтром.

3.4. Необходимые условия успешного проведения анализа.

Строгое соблюдение условий хранения компонентов тест-системы.

Разовое (однократное ) использование наконечников и пробирок. Ранее 
использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя!

При составлении смеси для амплификации вначале готовить 
отрицательный контроль, а последним - положительный контроль.

Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или
тщательно обработана хромпиком и отмыта.

4. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

Рекламации на качество данной тест-системы в соответствии с указанием 
Главного управления ветеринарии № 22-7/28 от 8 мая 1992 г. «О порядке 
предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и 
закупаемые по импорту» направляют предприятию-изготовителю (123098 
Москва, ул. Гамалеи, 16, НПО НАРВАК), во Всероссийский государственный 
научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации 
ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022 Москва, Звенигородское 
ш., 5 и ЦНПВЛ (Москва, Косино, Оранжерейная, 23). При наличии невскрытых 
тест-систем данной серии одну тест-систему направляют в ВГНКИ.

Наставление разработано НПО НАРВАК, одобрено Советом по 
ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ 
18.06.1998 г., протокол № 3, №________.

Начальник отдела ветеринарно-санитарной экспертизы и лабораторной работы
В.И.Белоусов