Наставление по применению набора для иммуноферментной
диагностики инфекционного ринотрахеита
крупного рогатого скота
1. Общие сведения
2. Механизм (принцип) реакции
3. Применение набора
-приготовление растворов;
-проведение реакции;
-учет результатов реакции;
4.Предъявление рекламации
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСcИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
№ 13-7-2/1492 от 09 Февраля 1999 г. В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по применению набора для иммуно-
ферментной диагностики инфекци-
онного ринотрахеита крупного
рогатого скота
1. Общие сведения
1.1. Набор предназначен для иммуноферментной диагностики
инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС) пу-
тем постановки твердофазного иммуноферментного анализа (КФА) и
для массового серологического обследования поголовья крупного
рогатого скота на наличие антител к вирусу ИРТ.
1.2. Набор представляет собой комплект биологических и хи-
мических компонентов и двух полистироловык 96-луночнык микропа-
нелей, использующиеся при постановке реакции.
Биологические компоненты:
К n 1- положительный антиген ИРТ КРС - 2 куб.см, 1 флакон
(ампула), сухая пористая масса светло-розового цвета.
К n 2 - положительная сыворотка - 1 куб.см, 1 флакон (ампула),
сухая пористая масса светло-желтого цвета.
К n 3 - отрицательная сыворотка - 1 куб.см, 1 флакон (ампула),
сухая пористая масса светло-желтого цвета.
К n 4 - анти-igg КРС, меченный пероксидазой (коньюгат) -
О,2-2,О куб.см, 1-2 флакона (ампулы), сухая пористая масса.
К n 5 - инертный белок - 1 куб.см, 1 флакон (ампула), сухая
пористая масса белого цвета.
Химические компоненты:
К n 6 - КН2РО4 - в 1 флаконе 1,36 г
К n 7 - К2НРО4 х ЗН2О - в 1 флаконе 9,17 г
К n 8 - НаСi - в 1 флаконе 43,8 г
К n 9 - Твин-2О или тритон Х-305 - в 1 флаконе 2,5 куб.см
К n 10 - лимонная кислота - в 1 флаконе 0,98 г
К n 11 - К2НРО4 х ЗН2О - в 1 флаконе 2,26 г
К n 12 - ортофенилендиамин - в 1 флаконе О,02 г
К n 13 - гидроперит (Н2О2) - 1 таблетка
1.3. На ампулы (флаконы) с биологическими компонентами на-
бора должны быть наклеяны этикетки или нанесены несмываемой
краской следующие обозначения: номер компонента, краткое наиме-
нование препарата, рабочее разведение, номер серии, дата изго-
товления и срок годности.
На ампулах (флаконах) с химическими компонентами указывают:
номер и наименование компонента, дата изготовления, срок годнос-
ти.
1.4. Маркированные ампулы (флаконы) с компонентами набора
упакованы в картонные коробки с разделительными перегородками,
в коробку вложено наставление по применению набора. На коробку
наклеяна этикетка, на которой указано: наименование и товар-
ный знак предприятия-иэготовителя, наименование набора, перечень
компонентов, входящих в набор, номер серии, номер контроля, ко-
личество ампул (флаконов) каждого компонента в коробке, дата из-
готовления, срок годности, условия хранения, обозначение ТУ.
1.5. Флаконы (ампулы) с компонентами без этикетки, содержа-
щие посторонние примеси, с нарушением укупорки, трещинами к при-
менению не пригодны и выбраковываются.
1.6. Наборы транспортируют и хранят в сухом месте при тем-
пературе от 2 гр.С до 8 гр.С. Срок годности наборов 18 мес.
2. Механизм (принцип) реакции
Индикация образовавшегося комплекса антиген-антитело осу-
ществляется ферментативной меткой, которая детектируется визу-
ально или прибором.
3. Применение набора.
3.1. Приготовление растворов
Постановку реакции начинают с приготовления буферных раство-
ров:
3.1.1. Адсорбционный буфер, предназначенный для растворения
антигена, получают путем растворения содержимого флаконов с ком-
понентами nn 6, 7, 8 в 5,0 куб.дм дистиллированной воды, филь-
труют череэ бумажный фильтр, проверяют рН (7,2-7,4), при необхо-
димости корректируют О,1 КОН или НСi. (буфер хранят при 4 гр.С
1 месяц).
З.1.2. Инкубационный буфер, предназначенный для растворения
сывороток, конъюгата и промывки микропанелей, готовят добавлени-
ем к 4,5 куб.дм адсорбционного буфера содержимого флакона с компо-
нентом n 9 (буфер хранят при 4 гр.С 15 дней) .
3.1.3. Субстратный буфер (СБ) предназначен для индикаторно-
го реактива и готовится непосредственно перед использованием.
Растворяют содержимое флаконов с компонентами nn 10 и 11 каждый
в 50 куб.см дистиллированной воды. К 24,3 куб.см раствора компонента
n 10 добавляют 25,7 куб.см раствора компонента n 11 и 50 куб.см дис-
тиллированной воды. рН полученного раствора должен быть 5,0-5,2.
В случае необходимости добавляют раствор кислого (К n 10) или
щелочного (К n11) компонентов (буфер хранят при 4 гр.С в течение
7 суток, корректируя рН перед использованием).
3.1.4. Индикаторный реатив (ИР). Смешивают компонент n 12,
растворенный в 2 куб.см спирта-ректификата (раствор хранят при 4гр.С
в течение 7 суток) с 48 куб.см СБ и добавляют 0,8 куб.см гидроперита,
полученного путем растворения 1 таблетки (компонент n 13) в
10 куб.см дистиллированной воды (хранят при 4 гр.С в течение 7 суток) .
Готовый ИР необходимо использовать в течение 2-З ч.
При использовании для работы 1 плашки раствор компонента
n 12 в объеме 1 куб.см смешивают с 24 куб.см СБ и добавляют 0,4 куб.см
гидроперита.
3.2. Проведение реакции.
3.2.1. Содержимое ампулы (флакона) n1 - положительный ан-
тиген вируса ИРТ КРС - растворяют в 2О куб.см адсорбционного буфе-
ра.
Содержимое ампул (флаконов) с коньюгатом (К n 4) и инертным
белком (К n 5) растворяют каждый в 2О куб.см инкубационного буфера.
Положительную ИРТ КРС (К n 2) и отрицательную (К n 3) сыворотки
растворяют в 5 куб.см инкубационного буфера, получая разведение
1:200. Все препараты готовятся перед испольвованием.
3.2.2. В лунки полистироловых микропанелей вносят по
0,1 куб.см положительного антигена вируса ИРТ КРС, закрывают крыш-
кой и инкубируют в течение 18-24 ч. при 4 гр.С. Затем микропанели
промывают 3 раза инкубационным буфером.
3.2.3. Далее вносят 0,1 куб.см раствора инертного белка, инку-
бируют 30 мин при 37 гр.С, трижды промывают инкубационным буфером.
3.2.4. Затем в лунки вносят по 0,1 куб.см образца исследуемых
сывороток, начиная с разведения 1:200. Для удобства микропанель
делят на две части вдоль и каждую сыворотку исследуют в 4-х раз-
ведениях 200, 400, 800, 1600. Таким образом, на каждой микропа-
нели можно исследовать 22 пробы; для эпизоотологического обсле-
дования достаточно проверки сыворотки в одном разведении 1:200 в
двух повторах, т.е. для одной пробы используют 2 лунки, всего на
2-х микропанелях можно исследовать 88 проб. После внесения проб
сывороток микропанели инкубируют при З7 гр.С 1 ч, промывают 3 раза
инкубационным буфером.
3.2.5. Далее вносят в каждую лунку по 0,1 куб.см рабочего раз-
ведения коньюгата (К n 4), инкубируют при 37 гр.С 1 ч, затем промы-
вают 4-5 раз.
3.2.6. Индикаторный реактив вносят по 0,1 куб.см в каждую лун-
ку микропанели и выдерживают при температуре 20-22 гр.С 15-30 мин.
3.2.7. Проведение контролей: в 3 лунки вносят по 0,1 куб.см
отрицательной сыворотки (отрицательный контроль), в 4 лунки -
положительной сыворотки (положительный контроль), в 1 лунку -
только индикаторный реактив (контроль реактивов), используя для
этого ряд А.
3.2.8. В случае, если нет возможности провести учет реакции
через 15-30 мин, реакцию останавливают добавлением в каждую лун-
ку 0,05 куб.см серной кислоты, приготовленной путем растворения
2,0 куб.см концентрированной серной кислоты в 10,0 куб.см дистиллиро-
ванной воды.
3.3. Учет результатов реакции.
Результаты учитываются в течение З-х ч. после остановки реакции
виэуально или спектрофотометрически.
3.3.1. Визуальный учет: для постановки положительного диаг-
ноза на ИРТ КРС при визуальном учете достаточно окрашивание проб
сывороток животнык от оранжево-коричневого до коричневого цвета,
сравнимого с цветом раствора в положительном контроле и превыша-
ющим по интенсивности окраски в 2 раза отрицательный контроль.
Отрицательными считают пробы (разведения) исследуемого ма-
териала, которые не изменили окраску или имеют слабое пожелтение.
3.3.2. Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов
проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при дли-
не волны 495 нм.
Положительными считаются пробы, уровень оптической плотнос-
ти (ОП) которых, начиная с разведения 1:200, в 2 и более раза
превосходит уровень ОП отрицательного контроля, но при этом дол-
жен быть не ниже 0,200 единиц.
Сомнительные пробы - это те, уровень которых выше ОП отри-
цательного контроля и составляет 0,150-0,199 единиц.
Уровень ОП ниже 0,150 свидетельствует об отрицательной ре-
акции, об отсутствии анти-ИРТ- антител .
3.3.3. Для исключения ложно-положительной или ложно-отрица-
тельной реакций, в случае исследования сывороток переболевших и
вакцинированных животных, необходимо повторное исследование сы-
вороток, взятых через 18-21 сут. после первого исследования, от
этих же животных. Сыворотки хранят при минус 20 гр.С до повторного
исследования и исследуют одномоментно. При увеличении интенсив-
ности окраски диагноз считать положительным.
4. Предъявление рекламации.
В случае выявления неактивности препарата или неспецифичес-
кой реакции его применение прекращают и, в соответствии с указа-
нием ГУБ МСХ РФ от 08.05.92 г. n 22-7/28 "0 порядке предъявления
рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупа-
емые по импорту", сообщают предприятию-изготовителю, Всероссийс-
кому государственному научно-исследовательскому институту конт-
роля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов
(ВГНКИ, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5), Центральной
научно-методической ветеринарной лаборатории (ЦНМВЛ, 111622,
Москва, ул. Оранжерейная, 23).
Одновременно в адрес ВГНКИ отправляют невскрытый набор с
сопроводительным письмом.
С утверждением настоящего наставления прекращает свое дейс-
твие наставление по применению "Набора для иммуноферментной ди-
агностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота",
ГУВ Госагропрома СССР 02.01.89 г.
Настоящее наставление разработано Всероссийским научно-исс-
ледовательским и технологическим институтом (ВНИиТИБП) и одобре-
но Советом по ветеринарным препаратам 14.04.98, протокол n 2.
Начальник отдела лабораторной диагностики В.И.Белоусов