МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Утверждаю
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
Заместитель руководителя
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Департамент ветеринарии
(Минсельхозпрод России)
В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
№ 13-7-2/1874 от 10.02.2000
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ
ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГИСТАМИНА В
РЫБЕ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
РИДАСКРИН ГИСТАМИН (ridascreEn® histamin)
(производство
фирмы Ар-Биофарм/r-biopharm, Германия)
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения
гистамина в рыбе (скумбрия,
ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось
и др.) с помощью тест-системы для
иммунно-ферментного анализа ridascreEn® histamin*.
* ridascreEn® является зарегистрированным товарным знаком фирмы r-biopharm, Германия
2. Краткое описание методики
Пробоподготовка:
Холодное центрифугирование
Затраты времени:
Пробоподготовка
(при обработке 10-ти проб)
около 1-го часа
Анализ(независимо от
количества проб)
2 часа
Предел обнаружения:
2.5 мг/кг
Сходимость результата анализа:
коэффициент
вариации
не хуже 10 %
Извлекаемость:
80 - 95% (в зависимости от
концентрации гистамина)
Перекрестная чувствительность:
гистамин
100.00%
гистидин
около 0.005 %
спермидин
около 1.0 %
путресцин
около 0.2%
3. Общие положения
Гистамин являются одним из биогенных аминов, образующихся
в рыбе при
декарбоксилировании аминокислот, в том числе, в результате
деятельности бактерий. Поскольку
биогенные амины принадлежат к веществам, участвующим
в обмене веществ высших животных,
они легко метаболизируются и поэтому обычно хорошо переносятся
человеком, если их
концентрация в пище находится в пределах допустимого
уровня.
При бактериальном загрязнении рыбы повышение уровня содержания
биогенных аминов,
в частности гистамина, может причинить вред здоровью
потребителя. При содержании гистамина
выше обычного уровня естественный механизм детоксификации
аминов за счет деятельности
ферментов - аминооксидаз (гистаминазы) уже не справляется.
Повышенное поступление
гистамина может вызвать так называемую «гистаминовую»
мигрень (синдром Хортона), головную
боль (невралгия Харриса, характеризующаяся болью в области
глаз, лба, височной части головы,
слезотечением, воспалением слизистой носа) и другие симптомы,
включая тошноту, понос,
испарину, повышенное выделение желудочного сока, учащение
сердцебиения и снижение
диастол ического (нижнего) кровяного давления.
Бактерии enterobacteriaceae, в
частности колиформы, обладают высокой
декарбоксилизующей активностью, причем даже при стерилизации
рыбы наработка гистамина не
прекращается за счет деятельности активных ферментов.
Продуктами риска является в первую
очередь рыба богатая гистидином, в частности скумбрия,
ставрида, сайра, макрель, тунец,
сельдь, шпрот, лосось и некоторые другие продукты, например,
сыр, мясо, шампанское, вино,
пиво и кислая капуста.
Содержание гистамина в пище нормируется во всех
развитых странах и является
важнейшим показателем свежести рыбы. Так, например, согласно
СанПиН 2.3.2.560-96
Российской Федерации содержание гистамина в рыбе не должно
превышать 100 мг/кг, в
Соединенных Штатах норма гистамина составляет 50 мг/кг
(производители рыбных консервов
контролируют сырье по норме 5 - 15 мг/кг гистамина).
Традиционный фотоколориметрический метод контроля гистамина
в рыбе трудоемок,
занимает длительное время и характеризуется малой производительностью.
В последнее время в рутинной лабораторной практике широко
применяется более
удобный иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, elisa),
являющийся официальным методом
контроля, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/ЕЕС).
4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация
и общие правила
безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая
искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования
и номенклатура средств
защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная.
Цилиндры, мензурки, колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические
методы определения
свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые.
Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические
методы
определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и
образцовые. Общие
технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные.
Типы, основные
параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки
с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные.
Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки
градуированные. Общие
требования.
5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов
с антителами.
Планшет, входящий в состав набора ridascreEn® histamin,
сенсибилизирован
гистамином. Анализ выполняется следующим образом.
Исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий
антитела к гистамину
дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в
течение определенного времени
молекулы гистамина, содержащегося в пробе (в стандартном
растворе) и молекулы гистамина,
адсорбированные на поверхности планшета, конкурируя между
собой, взаимодействуют с
внесенными антителами к гистамину.
После промывки планшета в лунки вносится раствор, содержащий
вторичные антитела
коньюгированные с пероксидазой, которые во время второй
инкубации связываются комплексом
гистамин - антитело на поверхности планшета. Несвязанные
молекулы коньюгата удаляются при
очередной промывке.
В лунки затем дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида)
и раствор хромогена
(тетраметилбензидин). В процессе очередной инкубации,
при химическом взаимодействии
субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент
молекулы коньюгата, связанной на
поверхности лунки, выступает в качестве катализатора,
образуются окрашенные продукты
реакции. Через определенное время развития цветной реакции,
в результате которой бесцветный
хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется
стоп-реагент, при этом голубой цвет
раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре
(ридере) при 450 нм,
обратно пропорциональна концентрации гистамина в исследуемых
образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1. Предел обнаружения гистамина составляет:
•2.5 мг/кг при навеске образца 2 г
6.2. Диапазон определяемых концентрация гистамина составляет:
•2.5 - 202.5 мкг/л при навеске образца 2 г
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы
и материалы
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности
с наибольшим пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Дозаторы на 50, 100 и 250 мкл
Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 1000 мл
исп. 2 по ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью
1 и 10 мл по ГОСТ 29227
7.2. Вспомогательные устройства
Мясорубка по ГОСТ 4025
Центрифуга охлаждаемая с устанавливаемым ускорением 3000
д
Центрифужная пробирка на 20 мл с завинчивающейся крышкой
Устройство для встряхивания проб
Пипетки Пастера
Пробирки типа П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Стакан химический вместимостью 100 мл по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Груша резиновая
Холодильник бытовой
7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа ridascreEn®
histamin в
стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8
лунок),
сенсибилизированный гистамином
1 шт
Комплект стандартных растворов гистамина в воде со
следующими концентрациями (1 ррЬ=1мг/кг):
О ppb (нулевой стандарт), 50 ppb, 150 ppb, 450 ppb,
1350 ppb, 4050 ppb, по 1.2 мл
6 х 1 шт
Коньюгат антител с пероксидазой,
8 мл (красная крышка)
1 шт
Антитела к гистимину, 4 мл (черная крышка)
1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида,
7 мл (зеленая крышка)
1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензидин,
7 мл (голубая крышка)
1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты,
14 мл (желтая крышка)
1 шт
Буфер, для разбавления конц. растворов
коньюгата и антител, 25 мл
1 шт
Твин 20
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Дигидрофосфат натрия, дигидрат, nah2po4 x 2h2o
Гидрофосфат натрия, безводный, na2hpo4
Хлорид натрия, naci
Замечания по использованию и хранению тест-системы
ridascreEn® histamin
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере
чувствительности
определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами
из другого набора с
другим номером партии.
Храните набор при температуре 2 - 8 °С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ
НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте
их в срольгированный пакет
вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.
Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны,
избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы
с растворами.
Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора
хромогена не
рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание
раствора хромогена
является признаком его порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной
в лунке с нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком
порчи реагентов.
8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования
техники безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007,
требования пожарной безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019, а также
требования, указанные в технической документации на весы,
спектрофотометр и вспомогательные
устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений,
должно быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией.
9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
специалиста, имеющего
высшее или среднее специальное химическое образование
или опыт работы в химической
лаборатории, владеющего техникой иммунно-ферментного
анализа и освоившего метод в
процессе стажировки.
10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены
следующие условия:
Температура воздуха
20 ± 5 °С;
Атмосферное давление
84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха
не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети
220 ± 10 В;
Частота переменного тока
50 ± 1 Гц
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей
нормативной
документацией по отбору проб.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после
их отбора.
11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в
лабораторию. При отсутствии
такой возможности допускается хранение образцов не более
чем 2 суток с момента отбора при
температуре 2 - 8°С, либо 5-6 месяцев при температуре
- 20°С.
11.3. Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление 0.02 М фосфатного буферного раствора
ствином, рН 7.2
Взвешивают 2.3 г безводного гидрофосфата натрия, 0.62
г дигидрата дигидрофосфата
натрия и 9.0 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную
колбу на 1000 мл, добавляют 1 мл
твин-20 и доводят объем раствора до метки дистиллированной
водой. Раствор тщательно
перемешивают. Срок хранения раствора при температуре
2 - 8°С - 4 дня.
12. Пробоподготовка
12.1. Пробу рыбы измельчают с помощью мясорубки либо
другим способом.
12.2. Навеску 2 г фарша и 10 мл 0.02 М фосфатного буферного
раствора с твином
переносят в центрифужную пробирку на 20 мл, закрывают
пробирку герметичной крышкой и
энергично встряхивают в течение 30-ти минут с помощью
устройства для встряхивания проб, либо
вручную.
12.3. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют
при ускорении 3000 д и
температуре 4°С в течение 10 мин.
12.4. Верхний слой жира удаляется.
12.5. Часть водной вытяжки переносят в чистую пробирку на 5 мл.
12.6. Раствор разбавляют в десять раз фосфатным буферным
раствором, например,
переносят дозатором в чистую пробирку 100 мкп водной
вытяжки, добавляют 0.9 мл фосфатного
буфера и тщательно перемешивают.
12.7. Для анализа используют 50 мкп раствора.
13. Порядок проведения измерений
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений
с помощью тест-системы
ridascreEn® histamin.
Перед использованием тест-системы доведите температуру
всех реагентов до
комнатной (30 - 40 минут до температуры 18-20 °С).
Немедленно после использования охладите все оставшиеся
реагенты до температуры 2
8°С.
В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета.
Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа
существенно зависит от
тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно
следуйте описанной
далее процедуре отмывки планшета.
На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.
13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный
гистамином
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь
необходимое количество
стрипов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фолы-ированный
пакет вместе с
силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить
на хранение при температуре 2 -
8°С.
13.2.2. Стандартные растворы.
Стандартные растворы гистамина поставляются готовыми
для использования в
следующих концентрациях:
Стандарт 1
0 ррЬ
Стандарт 2
50 ppb
Стандарт 3
150 ppb
Стандарт 4
450 ppb
Стандарт 5
1350 ppb
Стандарт 6
4050 ppb
Примечание: 1 ppb = 1 мкг/кг
13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве,
необходимом для выполнения всех
запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите
координаты лунок, предназначенных
для стандартных растворов и подготовленных исследуемых
растворов. Пример формы записи
приведен на Рис.1.
| С1 | С1 | ПЗ | ПЗ | П11 | П11 | П19 | П19 | П27 | П27 | П35 | П35 |
| С2 | С2 | П4 | П4 | П12 | П12 | П20 | П20 | П28 | П28 | П36 | П36 |
| СЗ | СЗ | П5 | П5 | П13 | П13 | П21 | П21 | П29 | П29 | П37 | П37 |
| С4 | С4 | П6 | П6 | П14 | П14 | П22 | П22 | ПЗО | ПЗО | П38 | П38 |
| С5 | С5 | П7 | П7 | П15 | П15 | П23 | П23 | П31 | П31 | П39 | П39 |
| С6 | С6 | П8 | П8 | П16 | П16 | П24 | П24 | П32 | П32 | П49 | П49 |
| П1 | П1 | П9 | П9 | П17 | П17 | П25 | П25 | ПЗЗ | ПЗЗ | П41 | П41 |
| П2 | П2 | П10 | П10 | П18 | П18 | П26 | П26 | П34 | П34 | П42 |
Рисунок 1. Пример формы записи координат лунок перед выполнением
анализа
(С-стандарты, П-пробы).
13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл стандартных
и исследуемых растворов в
соответствующие пары лунок.
13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител
(здесь и далее
предпочтительно использование 8-ми канального дозатора,
при этом раствор удобно отбирать из
специальной ванночки или из чашки Петри). Путем осторожного
постукивания по краям планшета
перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на инкубацию
в темноте в течение одного часа
при комнатной температуре.
13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку
планшета и тщательно выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного
постукивания рамки с лунками по
столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки
250 мкл фосфатного буферного
раствора и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости
как описано выше. Повторите
процедуру промывки лунок еще два раза.
13.3.5. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл препарата
коньюгата. Путем осторожного
постукивания по краям планшета перемешайте раствор в
лунках и оставьте планшет на инкубацию
в темноте в течение получаса при комнатной температуре.
13.3.6. Промойте лунки планшета, следуя процедуре по
п. 13.3.4.
13.3.7. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена
в каждую лунку. Тщательно
перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в
течение 30 минут в темноте.
13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента
и хорошо перемешайте. В
течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте
оптическую плотность в каждой
лунке при 450 нм.
14. Обработка результатов исследования
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках
со стандартными и
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической
плотности, измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается
на 100. Таким образом, результат
измерения оптической плотности выражается в процентах
от оптической плотности лунки с
нулевым стандартом, то есть:
Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
—————————————-————————x 100 = % поглощения
Средняя оптическая плотность лунки
с нулевым стандартом
По величинам относительного поглощения, вычисленным для
стандартных растворов и
соответствующим значениям концентрации гистамина в мкг/кг
(ppb) строится калибровочная кривая
в полулогарифмической системе координат. Калибровочная
кривая должна быть почти линейна в
диапазоне 150 - 1350 мкг/кг (см. Рис. 2).
Оптическая плотность,
(%)
Фактор разбавления для проб рыбы равен 50.
15. Интерпретация результатов исследования
При контроле проб рыбы на соответствие санитарно-гигиеническим
требованиям к качеству
и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов,
принятым в Российской
Федерации, найденная концентрация гистамина более 100
мг/кг (более 2000 мкг/кг по
калибровочной кривой) позволяет рассматривать исследуемую
рыбу как несоответствующую
санитарно-гигиеническим требованиям.
При меньшем содержании гистамина в рыбе найденная величина
концентрации позволяет
классифицировать рыбу по уровню свежести.
РАЗРАБОТАНО:
Представитель r-biopharm в России и
Начальник отдела лабораторной
странах СНГ
диагностики Департамента
Директор 000 “СТАЙЛАБ”
ветеринарии Минсельхозпрода России
А.В.Галкин
В.И. Белоусов
Методика апробирована в Центральной научно-методической
ветеринарной
лаборатории Департамента ветеринарии Минсельхозпрода
России (ЦНМВЛ) и во
Всероссийском научно-исследовательском институте мясной
промышленности
(ВНИИМП)
Директор ЦНМВЛ
Заведующая отделом ИФА
В.А. Седов
О.Н. Виткова
Зав. лабораторией ВНИИМП
Ю.Г. Костенко