Министерство
 сельского хозяйства                                       Утверждаю
  и продовольствия                             Заместитель руководителя
 Российской Федерации                    Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)                                    В.В.Селиверстов

Департамент ветеринарии

24.03.99г. от 13-7-2/1538

                       МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
            по ускоренной индикации эпизоотических штаммов
               морганелл в реакции нейтрализации антител

1. Общие положения

1.1. Энтеробактерии рода morganella   представлены в современной классификации 
единственным видом morganella morganii, в преобладающем большинстве случаев они 
обладают патогенными свойствами и наряду с другими бактериями семейства 
enterebacteriaceae вызывают кишечные и септические заболевания у молодняка 
сельскохозяйственных животных, у которых болезнь часто протекает в форме смешанной 
инфекции. В настоящее время известно около 50 серологических групп морганелл, однако 
энзоотические вспышки диареи у сельскохозяйственных животных обусловливает 
ограниченное число серогрупп этих бактерий, некоторые из которых вызывают 
заболевания и у людей.

1.2. Ускоренную индикацию патогенных серологических групп морганелл, наиболее 
часто циркулирующих на животноводческих фермах, проводят в реакции нейтрализации 
антител (РНАт), которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что 
исключает необходимость проведения бактериологического исследования материала, 
предусматривающего видовую идентификацию выделенных культур бактерий. Показатели 
РНАт позволяют установить не только наличие морганелл в материале, но и уровень их 
концентрации, что особенно важно для прижизненной диагностики болезни при 
исследовании фекалий больных животных, а также при санитарно-бактериологической 
оценке объектов внешней среды.

1.3. На основе определения соматического 0-антигена морганелл РНАт дает
возможность выявить наличие данных бактерий как в чистых, так и смешанных культурах, 
полученных при исследовании различных материалов независимо от присутствия в них 
посторонних микроорганизмов. Продолжительность исследования культур в РНАт 
составляет 6-7 ч.

1.4. РНАт относится к 3-х компонентным серологическим реакциям и проходит в 
две фазы. В первой фазе (визуально невидимой) участвуют искомые бактерии (0-антиген 
морганелл), содержащиеся в исследуемом материале, и специфические антитела 
морганеллезной агглютинирующей 0-сыворотки. Во второй фазе реакции принимает 
участие морганеллезный эритроцитарный диагностикум, гомологичный серогруппе 
сыворотки.

При наличии в исследуемом материале искомых бактерий последние связываются со 
специфическими антителами агглютинирующей сыворотки  (1-ая фаза) и после добавления 
к указанным компонентам морганеллезного эритроцитарного диагностикума (2-ая фаза) 
гемагглютинации не наступает - положительный результат РНАт. Если в исследуемом 
материале отсутствуют искомые бактерии, то антитела специфической сыворотки остаются 
свободными в 1-oй фазе реакции и связываются с морганеллезным диагностикумом 
соответствующей серогруппы , ввиду чего во 2-oй фазе реакции происходит агглютинация 
эритроцитов, которые выпадают в осадок с образованием "зонтика" на дне лунок 
полистироловой пластины - отрицательны результат РНАт.

1.5. Точность показаний РНАт, как и других серологических реакций, зависит от 
правильно подобранного количественного соотношения компонентов реакции, которое 
устанавливают путем определения активности эритроцитарных диагностикумов и рабочих 
титров агглютинирующих сывороток используемых при постановке РНАт.

Оптимальное соотношение указанных компонентов определяют в реакции непрямой 
гемагглютинации (РНГА) после приобретения наборов морганеллезных эритроцитарных 
диагностикумов и морганеллезных агглютинирущих серогрупповых сывороток, затем 
через каждые 5-6 мес. их хранения, а также в случае отсутствия гемагглютинации в 
контроле титра сыворотки, взятого для постановки РНАт.

2. Определение активности морганеллезных эритроцитарных
диагностикумов и титров агглютинирующих морганеллезных
серогрупповых сывороток, используемых для постановки РНАт
 
2.1. Компоненты реакции и оборудование.
2.1.1. Для постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) используют следующие 
компоненты и оборудование:

набор диагностикумов морганеллезных эритроцитарных и нормальные 
формалинизированные эритроциты барана (3,5-4%-ная взвесь);
набор сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих серогрупповых;
забуференный физиологический раствор, pН 7,0-7,2 ;
стандартные полистироловые пластины с лунками, имеющие выпукло-вогнутое дно;
автоматическую мерную пипетку или полуавтоматический шприц, установленный 
на объем 0,4 см3 ;
капельницы или пастеровские пипетки;
стеклянные стаканчики для промывания наконечника мерной пипетки или шприца и 
слива жидкости.

2.2. Постановка реакции.
2.2.1. Для постановки РhГa используют свежий забуференный физиологический 
раствор, содержащий 0,85%  хлористого натрия, с рН 7,0-7,2. Для установления нужной 
величины рН предварительно готовят 1/15 М растворы двузамещенного фосфорнокислого 
натрия (na2hpo4x12h2o) и однозамещенного фосфорнокислого калия (kh2po4). С этой 
целью в первую мерную колбу вносят 23,0 г na2hpo4, a затем доливают 
дистиллированную воду до отметки одного литра. Во вторую мерную колбу вносят 9,0 г 
КН2РО4 и также наливают в нее дистиллированную воду до отметки одного литра, 
компоненты в мерных колбах тщательно растворяют путем встряхивания колб. Колбы с 
полученными 1/15 М растворами солей закрывают резиновыми или корковыми пробками и 
хранят в темном месте при комнатной температуре в течение 6 мес.

Для получения забуференного физраствора с рН 7,0-7,2 необходимо 
дистиллированную воду прокипятить в течение 10-15 мин., чего у нее определяют рН и при 
наличии его показателя в пределах 6,2-6,6 воду используют для приготовления обычного 
физиологического раствора. Затем к литру указанного раствора добавляют 10 куб.см смеси 
1/15 М растворов na2hpo4 и kh2po4 в соотношении 7:3 или 8:2 (в зависимости от 
исходной величины рН воды) ,компоненты в колбе тщательно перемешивают.

2.2.2.  Определение активности эритроцитарных морганеллезных диагностикумов 
проводят по следующей методике:

автоматической мерной пипеткой или полуавтоматическим шприцом разливают во 
все лунки полистироловой пластины (кроме первой лунки каждого ряда) по 0,4 см3 
забуференного физраствора;

предварительно разведенную в забуференном физрастворе 1:100 серогрупповую 
морганеллезную агглютинирующую сыворотку вносят мерной пипеткой по 0,4 cм3 в 
первую и вторую лунки двух рядов полистироловой пластины и в две пустые лунки 
отдельной пластины, предназначенной для контроля сывороток и эритроцитарных 
диагностикумов (двукратное исследование каждого компонента реакции проводят с целью 
получения более достоверного показателя). С левой стороны пластин (на широком крае) 
напротив соответствующих  рядов лунок чернилами для  стекла обозначают серогруппу 
агглютинирующей сыворотки. Таким же образом разливают другие серогрупповые 
морганеллезные сыворотки в каждые последующие два ряда лунок полистироловой 
пластины. В реакции используют сыворотки, соответствующие серогруппам 
эритроцитарных морганеллезных диагностикумов, в  разведениях от 1:100 до i:204800. Для 
получения указанных разведений сыворотку размешивают в забуференном физрастворе во 
второй лунке ряда с помощью автоматической мерной пипетки или полуавтоматического 
шприца, снабженного толстой длинной иглой, путем отсасывания и выливания жидкости в 
эту же лунку (3-4 раза), затем переносят 0,4 см3 разведенной l:200 сыворотки в третью 
лунку ряда. Далее таким же образом приготавливают следующие разведения - 1:400, 1:800 
и т.д. Из последней 12-й лунки ряда с разведением сыворотки 1:204800 удаляют 0,4 см3  
жидкости, чтобы объемы сыворотки во всех лунках были одинаковыми (по 0,4 см3).  После 
разведения каждой серогрупповой сыворотки наконечник автоматической мерной пипетки 
или шприц с толстой иглой на конце промывают забуференным физраствором  3-4 раза. 
Сыворотки всех серогрупп, участвующие в РНГa, разводят аналогичным способом;

во все лунки двух рядов пластины с разведениями сыворотки от 1:100 до 1:204800 
пастеровской пипеткой или капельницей добавляют по 1 капле (0,05 см3) морганеллеэного 
эритроцитарного диагностикума, гомологичного серогруппе морганеллезной 
агглютинирующей сыворотки. В лунки следующих двух рядов пластины добавляют другой 
эритроцитарный 

диагностикум, соответствующий серогруппе сыворотки и т.д.;

после добавления диагностикумов во все ряды полистироловой пластины 
последнюю осторожно встряхивают (не отрывая от поверхности стола, чтобы не 
выплеснуть содержимое лунок) для размешивания компонентов и оставляют её при 
комнатной температуре (18-22 С)  на 3 ч, затем проводят учет результатов реакции.

Одновременно на отдельной полистироловой пластине ставят следующие контроли: 
1) контроль сывороток (для исключения неспецифической гемагглютинации) - в каждую 
разведенную 1:100 агглютинирующую морганеллезную О-сыворотку (разлитую в две 
лунки по 0,4 ом3) добавляют по 1 капле (0,05 см3) 3,5-4%-ной взвеси нормальных 
формалинизированных эритроцитов барана; 2) контроль эритроцитарных диагностикумов 
(для исключения спонтанной агглютинации сенсибилизированных эритроцитов) в две 
лунки с 0,4 см3 забуференного физраствора добавляют по 1 капле (0,05 см3) 
эритроцитарного диагностикума определенной серогруппы. Аналогичным образом 
поступают со всеми диагностикумами других серогрупп. Предварительно напротив лунок 
(на широком крае пластины) чернилами для стекла обозначают серогруппы сывороток и 
диагностикумов, подвергаемых контролю. После добавления в лунки компонентов 
контролей пластины осторожно встряхивают для размешивания эритроцитов и оставляют 
их также при комнатной температуре на 3 ч.

2.3. Учет результатов РНГА.
2.3.1. Во всех лунках полистироловой пластины с контролями сывороток и 
эритроцитарных диагностикумов должны быть отрицательная реакция (отсутствие 
гемагглютинации, форма осадка эритроцитов в виде диска с ровными краями).

При положительной РНГА происходит агглютинация эритроцитов. Осевшие на дне 
лунок эритроциты имеют вид "зонтика" с неровными краями (обозначается знаком "+").  
При отрицательной реакции (обозначается знаком "_") эритроциты оседают на дне лунок в 
виде диска или кольца с ровными краями. Если образуется осадок эритроцитов в виде 
нечеткого, неправильной формы кольца с неровными краями, реакцию считают 
сомнительной (обозначается знаком "+,-").

2.3.2. Активность эритроцитарных морганеллезных диагностикумов устанавливают 
по наибольшему разведению гомологичной морганеллезной агглютинирующей 0-
сыворотки, в котором отмечается положительная РНГА. Данный показатель разведения 
сыворотки соответствует одной гемагглютинирующей единице (1 ГЕ).

В том случае, если активность морганеллезного диагностикума равна показателю 
менее 1:6400, его необходимо проверить с гомологичной морганеллезной О-сывороткой 
другой серии. Диагностикум, имеющий в РНГА активность с гомологичными 
агглютинирующими сыворотками разных серий титр ниже 1:6400, для постановки РНАт  
не пригоден.

2.3.3. Титр морганеллезной агглютинирующей О-сыворотки, необходимый для 
постановки РНАт, устанавливают из расчета двух гемагглютинирующих единиц (2 ГЕ), 
принимая за 1 ГЕ показатель активности гомологичного, эритроцитарного диагностикума.

Например, если показатель 1 ГЕ равен разведению сыворотки 1:12800, то 2 ГЕ будут 
соответствовать разведению сыворотки 1:6400. Исходя из того, что в РНАт участвуют 
помимо эритроцитарного диагностикума и агглютинирующей сыворотки еще исследуемый 
материал и последние два компонента используются в объеме по 0,2 куб.см, для 
сохранения разведения сыворотки равного 2 ГЕ в смеси указанных компонентов нужно 
взять разведение ее в 2 раза меньше. В частности, если показатель титра сыворотки равны 2 
ГЕ составляет разведение 1:6400, то для сохранения его в объеме всех компонентов 
реакции необходимо приготовить разведение сыворотки 1:3200 (4 ГЕ).

3.Подготовка материала для исследования
и методика постановки РНАт

        3.1. Подготовка культур бактерий, выделенных из патологического материала, мяса 
и субпродуктов, кормов, объектов внешней среды.

3.1.1. Исследованию в РНАт подлежат культуры бактерий (чистые или смешанные), 
полученные на плотной селективной питательной среде – агаре  Плоскирева, висмут-
сульфит агаре или др. после посева фекалий больного диареей молодняка, материала из 
внутренних органов и тканей вынужденно убитых или погибших от желудочно-кишечных 
заболеваний животных, а также мяса и субпродуктов, кормов, сточных вод, соскобов и 
смывов с поверхностей помещений и оборудования фермы при их санитарно-
бактериологической оценке на наличие лактозоотрицательных энтеробактерий - 
возбудителей кишечных инфекций  молодняка.

3.1.2. Выросшие на плотной селективной среде 18-24-х часовые культуры бактерий 
просматривают с помощью лупы и при наличии роста мелких полупрозрачных, круглых  
колоний s-формы серовато-голубого цвета на агаре Плоскирева или аналогичных по 
размеру и форме колоний зеленовато-оливкового цвета на висмут-сульфит агаре 
пересевают по 2-3 указанные колонии с каждой чашки на скошенный МПА для 
последующего изучения культур с целью их родовой и видовой идентификации, а затем 
вливают в чашку 6-8 куб см стерильного забуференного физраствора (рН 7,0-7,2) и 
стеклянным шпателем суспендируют культуру со всей поверхности среды в чашке. после 
чего отсасывают суспензию пастеровской пипеткой. соединенной с резиновой грушей. и 
переносят ее в стерильную маркированную пробирку. В случае роста вышеуказанных 
колоний в культурах из нескольких органов и тканей одного трупа животного 
приготовленные в этих чашках суспензии (каждую в концентрации 2-4 млрд микробных 
клеток/куб.см) отсасывают пипеткой в объеме по 1.5-2 куб.см. переносят в стерильную 
маркированную пробирку, затем смесь перемешивают путем пипетирования или 
встряхивания пробирки.

3.1.3. Приготовленные суспензии бактерий прогревают в водяной бане при 100 С в 
течение 15-20 мин с момента закипания воды с целью обеззараживания материала. Уровень 
воды в бане должен быть несколько выше уровня жидкости в пробирках. Суспензии 
бактерий, подвергнутые термической обработке, исследуют в РНАт.
        
           3.2. Постановка РНАт.
        3.2.1. Во все лунки полистироловых пластин, расположенных на столе в 
вертикальном положении и таким образом, чтобы их широкий край находился с левой 
стороны, разливают автоматической мерной пипеткой или полуавтоматическим шприцом 
по 0,2 куб.см забуференного физраствора (рН 7.0-7.2).
        
            3.2.2. Исследуемую суспензию бактерий разводят в забуференном физрастворе, 
находящегося в лунках пластины, от 1:2 до 1:64 (не считая исходного разведения) в объеме 
по 0,2 куб.см. С этой целью в первую лунку каждого ряда пластины вносят автоматической 
мерной пипеткой или полуавтоматическим шприцом 0,2 куб.см суспензии бактерий,  затем 
этой же автоматической пипеткой или тем же шприцом, на конце которого имеется толстая 
короткая игла, размешивают ее путем 3-4-х кратного отсасывания и выливания в лунку, 
после чего разведенный в 2 раза материал переносят в объеме 0,2 куб.см в следующую 
лунку ряда полистироловой пластины.
        
Аналогичным образом готовят разведение материала во второй и последующих лунках 
ряда. Из последней шестой лунки ряда удаляют 0,2 куб.см разведенной суспензии 
бактерий. Число рядов лунок с разведенным одним и тем же материалом должно 
соответствовать количеству серогрупповых агглютинирующих сывороток и 
эритроцитарных диагностикумов, используемых в РНАт.

        3.2.3. Предварительно до начала постановки РНАт разводят в забуференном 
физрастворе  (рН 7,0-7,2) серогрупповые агглютинирующие морганеллезные сыворотки в 
чистых сухих пробирках с помощью мерных пипеток вместимостью 1 и 5 куб.см, 
последние разведения которых должны иметь титры равные 4 ГЕ. Для этого вначале 
готовят исходное разведение сыворотки 1:100 – к 9,9 куб.см забуференного физраствора 
добавляют 0,1 куб.см нативной сыворотки. Последующие разведения сыворотки 
двукратные в объеме по 5 куб.см , в последней пробирке объем разведенной сыворотки 
должен быть 10 куб см. Важным условием правильного приготовления рабочих титров  
сывороток является тщательное перемешивание их в каждой пробирке с забуференным 
физраствором путем 3-4-х кратного пипетирования. Приготовленные для постановки РНАт 
разведения сывороток ( в титре 4 ГЕ, а также в предшествующих им разведениях) можно 
использовать в течение 5-6 суток при условии хранения в холодильнике (2-4 С).

        3.2.4. На левой стороне полистироловой пластины с разведенной суспензией 
бактерий напротив каждого ряда лунок чернилами для стекла обозначают серогруппу 
агглютинирующей сыворотки (последней будет соответствовать и серогрупповой 
эритроцитарный диагностикум), а внизу пластины указывают номер экспертизы 
исследуемого материала.

        3.2.5. Во все лунки ряда с разведенным материалом автоматической мерной 
пипеткой или полуавтоматическим шприцом добавляют по 0,2 куб.см морганеллезной 
агглютинирующей сыворотки той серогруппы, которая обозначена на левой стороне 
полистироловой пластины, в разведении, соответствующему  4 ГЕ.

        Это же разведение агглютинирующей сыворотки вносят в 2 лунки отдельной 
пластины, предназначенной для контроля сыворотки, куда предварительно наливают 
забуференный физраствор в количестве по 0,2 куб.см. Число пар лунок с физраствором 
должно соответствовать количеству серогрупп агглютинирующих сывороток, 
подвергаемых контролю. На верхнем крае контрольной пластины, расположенной 
горизонтально, напротив каждых находящихся ниже двух лунок, чернилами для стекла 
обозначают серогруппу сыворотки. Наконечник мерной пипетки или полуавтоматический 
шприц после разлива каждой серогрупповой сыворотки промывают забуференным 
физраствором 3-4 раза.

        После добавления марганеллезных агглютинирующих сывороток к разведенной 
суспензии бактерий полистироловые пластины осторожно встряхивают (не отрывая от 
поверхности стола) для размешивания компонентов реакции и помещают в термостат (37-
38 С) на 1 час.

        3.2.6. Через 1 ч их извлекают из термостата и во все лунки одного ряда 
полистироловой пластины добавляют морганеллезный эритроцитарный диагностикум, 
соответствующий серогруппе агглютинирующей сыворотки. В лунки следующего ряда 
добавляют другой диагностикум гомологичный серогруппе сыворотки и т.д. Диагностикум 
вносят пастеровской пипеткой или капельницей по 1 капле (0,05 куб.см) в лунку. 
Предварительно флаконы с эритроцитарными диагностикумами тщательно встряхивают 
для получения гомогенной взвеси эритроцитов. Перед добавлением диагностикумов под 
пластину с компонентами реакции подкладывают белый лист бумаги с целью улучшения 
видимости содержимого лунок.

        Пластины вновь осторожно встряхивают, не отрывая от поверхности стола, для 
равномерного размешивания эритроцитов в смеси компонентов реакции, находящихся в 
лунках, и оставляют их при комнатной температуре (18-22 С) на 3 ч, после чего учитывают 
результаты РНАт.

        Одновременно на отдельных пластинах ставят 2 контроля: 1) контроль 
гемагглютинирующей способности сыворотки –в каждую использованную серогрупповую 
морганеллезную агглютинирующую сыворотку  в разведении равному 2 ГЕ и в объеме 0,4 
куб.см, разлитую в 2 лунки, добавляют по 1 капле (0,05 куб.см) гомологичного 
эритроцитарного диагностикума и 2) контроль исследуемого материала для исключения 
неспецифической аглютинации эритроцитов – в лунки с разведениями суспензий бактерий 
от 1:2 до 1:64 в объеме по 0,4 куб.см добавляют по 1 капле 3,5-4%-ой взвеси нормальных 
формалинизированных эритроцитов барана. Пластины с контрольными компонентами 
осторожно встряхивают с целью получения гомогенной взвеси эритроцитов и оставляют 
при комнатной температуре на 3 ч,  затем учитывают результаты.

        3.3. Учет результатов РНАт
        3.3.1. Учет результатов начинают с контрольных пластин. В контроле сывороток 
должна присутствовать агглютинация эритроцитов с образованием «зонтика» с неровными 
краями на дне лунок, в контроле исследуемого материала – отсутствие гемагглютинации, 
осадок эритроцитов на дне лунок имеет форму диска c ровными краями.

        3.3.2. Реакцию считают положительной (обозначается знаком «+»), если эритроциты 
выпадают в осадок, имеющего форму диска или четкого кольца с ровными краями в 
разведении исследуемого материала от 1:8 (третья лунка ряда пластины) и выше. Наличие 
положительной реакции во всех лунках ряда указывает на высокую концентрацию 
бактерий, соответствующих серогруппе эритроцитарного диагностикума и гомологичной 
ему агглютинирующей сыворотки. Положительная реакция только в первых двух лунках 
ряда, а также в контроле исследуемого материала в разведениях 1:2-1:4 не принимается во 
внимание ввиду возможности неспецифической агглютинации эритроцитов, 
обусловленной присутствием в суспензии бактерий тех или других химических примесей, 
которые попадают в нее при смыве культуры с селективной питательной среды.

        Критерием циркулирования на ферме эпизоотических штаммов морганелл является 
повторяемость результатов исследования – обнаружение в большинстве проб материала 
бактерий одних и тех же серологических групп.

        3.3.3. При отрицательной реакции (обозначается знаком «-») осадок эритроцитов на 
дне лунок имеет форму «зонтика» с неровными краями, что указывает на отсутствие в 
исследуемом материале морганелл серологических групп, соответствующих 
использованным эритроцитарным диагностикумам.

        3.3.4. Сомнительная реакция (обозначается знаком «+») проявляется наличием 
осадка эритроцитов в виде нечеткого кольца неправильной формы с неровными краями в 
большинстве или всех лунках ряда полистироловой пластины.

        3.3.5. При положительном результате экспертизы ответ формулируют «В 
присланном материале (указать в каком) обнаружен возбудитель кишечной инфекции – 
morganella morganii  серогруппы … ».

        Диагноз на заболевание ставят на основании совокупности эпизоотологических 
данных, клинических признаков болезни, патологоанатомической картины и 
положительного результата лабораторного исследования патологического материала.

        Методические указания разработаны Всероссийским научно-исследовательским 
институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ).