Методические указания по определению патогенности аэромонад по степени ДНКазной активности

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по определению патогенности аэромонад по степени ДНКазной активности

i. Общие положения

1.1. Метод определения патогенности бактерии путем исследования активности бактериальных ферментов позволяет судить о потенциальной способности бактерий вызывать патологический процесс.
1.2. Патогенность (вирулентность) аэромонад зависит от активности продуцирования экстрацеллюлярных энзимов - факторов нестабильности, к которым относится и ДНКаза (дезорксирибонуклеаза);
1.3. ОпределениеДНКазы используется как косвенный метод определения патогенности. Применение метода ДНКазной активности позволяет получить ответ через 48 часов.

2. Проведение исследования

2.1. Навеску ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) из расчета 200 мг/100 мл среды растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, подщелоченной in раствором naoh, вносят в расплавленный мясо-пептонный агар и стерилизуют однократно текучим паром 30 мин. Перед посевом агар расплавляют и стерильно добавляют на каждые 100 мл среды 0,8 мл 10%-ного СаСl2. Расплавленный агар разливают в чашки Петри по 25 мл; после застывания агара чашки подсушивают в термостате.
2.1.1. Можно использовать готовую среду фирм difco или gibco.
2.2. Перед посевом дно чашки расчерчивают карандашом по стеклу на 6-16 секторов (радиальных или прямоугольных), в каждом секторе ставят соответствующий порядковый номер.
2.3. Для посева используют суточную агаровую культуру испытываемого штамма. Посев производят уколом в центр сектора, не доводя петлю до дна чашки. Для удобства обозначения каждую культуру условно нумеруют от единицы и далее.
2.4. Чашки инкубируют при температуре 25-30°С в течение 48 часов.
2.5. После инкубации на поверхность среды наносят 8-10 мл in раствора НС1, чашки слегка покачивают для равномерного смачивания поверхности среды. Через 10 мин. кислоту сливают и учитывают результат.

3. Учет результатов

3.1. Соляная кислота осаждает только полимерную ДНК, образуя хлопьевидный преципитат, в результате чего среда становится матовой. ДНК, денолимеризованная дезоксирибонуклеазой, продуцируемой бактериями, не осаждается, и вокруг этих макроколоний образуются прозрачные зоны.
3.2. Ширина зоны деполимеризации зависит от степени ДНКазной активности и измеряется миллиметровой бумагой от края макроколонии до конца зоны просветления. Учет проводят в миллиметрах ширины зоны деполимеризации или в четырехплюсовой системе:
+ - зона деполимеризации до 2 мм,
++ - зона деполимеризации 2-3 мм,
+++ - зона деполимеризации 3-5 мм,
++++ - зона деполимеризации 5 мм и более.
3.3. Культуры аэромонад, выделенные из патматериала, дающие зону деполимеризации до 2 мм - слабовирулентные, до 4 мм -вирулентные, более 4 мм - высоковирулентные.

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу "Методические указания по определению патогенности аэромонад по степени ДНКазной активности", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 8.05.87, № 432-5.